图1、TKG-Y开菲尔粒的微生物组成分析。图1A与B：通过环形图展示TKG-Y中细菌（A）和真菌（B）的群落结构。细菌以乳杆菌科（Lactobacillaceae,73.76%）和醋酸杆菌科（Acetobacteraceae,25.61%）为主，真菌以酵母菌科（Saccharomycetaceae,91.87%）占绝对优势。图1C与1D：基于邻接法构建的系统发育树，显示所有操作分类单元（OTUs）的进化关系，进一步验证物种分类的准确性。图1E与1F：通过KEGG通路和FUNGuild功能预测，分析微生物群落的代谢功能。细菌功能主要集中在代谢、遗传信息处理等途径，而真菌主要参与碳水化合物代谢和脂肪酸延伸等过程。
图2、TKG-Y的宏观与微观形态。图2A：TKG-Y的宏观形态呈白色不规则颗粒状，具有弹性且中心有可见空隙。图2B与2C：扫描电镜（SEM）图像显示TKG-Y表面呈多孔网状结构（B），酵母菌主要分布在外层（C），内部微生物密度较低。
图3、BLIS的抗菌活性分析。图3A与3B：通过时间-杀菌曲线展示BLIS对病原菌的抑制效果。低浓度（1×MIC）的BLIS可显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，延长其滞后期，且对革兰氏阳性菌的抑制效果更强。图3C：BLIS对混合病原菌（金黄色葡萄球菌+大肠杆菌）的抑制效果，表明其在高浓度混合菌群中仍能发挥作用。
图4、KYS-164的传代稳定性与耐药性。图4A与4B：通过药敏试验显示，KYS-164在80代传代后未对20种常见抗生素（如CAZ、CTR等）产生耐药性，证明其遗传稳定性。图4C：BLIS在传代过程中（每10代检测）保持稳定的抗菌活性，说明其生产潜力可持续。
图5、发酵乳风味物质的GC-IMS分析。图5A：动态监测KYS-164发酵乳中挥发性成分的变化。发酵48小时后，醛类（如庚醛）、酯类（如乙酸苯乙酯）和醇类等物质显著增加，赋予产品花香、果香和坚果香。图5B：GC-IMS二维谱图对比KYS-164发酵乳与TKG-Y发酵乳的风味差异。KYS-164单独发酵能更快产生丰富风味，而TKG-Y需更长时间。图5C：指纹图谱显示，发酵3天是风味形成的最佳阶段，第4天部分风味物质（如4-甲基酚）开始衰减。
总结
西藏开菲尔粒（Tibetan kefir grains,TKGs）是一种传统的发酵乳制品，含有复杂的微生物群落，被认为具有多种益生健康功效。然而，其复杂的菌群结构限制了大规模应用和新抗菌物质的发现。本研究旨在深入分析一种来自西藏牧民自制开菲尔粒（TKG-Y）的微生物组成，并从中筛选、鉴定具有抗菌潜力和发酵能力的特定菌株，为其后续应用研究提供基础。本研究首次从西藏开菲尔粒中鉴定出一株能够产生类细菌素（BLIS）的沃氏葡萄球菌KYS-164。该菌株不仅表现出显著的抗菌活性，还具备良好的遗传稳定性、安全性和乳品发酵能力，能赋予发酵乳独特而丰富的风味。这项研究不仅揭示了自制开菲尔粒TKG-Y的菌群组成信息，更重要的是发现并证实了S.warneri KYS-164在食品防腐和乳品发酵工业中的应用潜力，为后续对该菌株的应用开发（如作为益生菌或天然防腐剂）奠定了坚实的基础。
Bioscreen C自动生长曲线分析仪监测S.warneri KYS-164自身在MRS中的生长曲线。实时记录未活化/活化后的病原菌（大肠杆菌366-a、金黄色葡萄球菌CICC 10384及其混合菌）在1×或4×MIC的BLIS作用下的吸光度变化，绘制抑菌-杀菌曲线，比较添加与未添加BLIS的病原菌在100孔板中每小时600 nm自动读数，量化BLIS对延滞期、生长速率及最终菌量的影响。Bioscreen通过高通量、连续、无手动干预的600 nm吸光度采集，为论文提供了精确到小时的生长动力学数据，从而客观评价KYS-164菌株及其抗菌代谢物BLIS的抑菌时效与剂量效应，是整个“抗菌活性”与“稳定性”证据链的核心实验平台。
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