不同方法对活体原核群落表征准确性的评估本研究通过以总DNA提取为对照，确定土壤中活体原核生物的多度和多样性，对不同方法所表征土壤原核生物多度和多样性的准确性进行评估。采用这种方法是因为模拟群落主要由活菌组成，灭菌土壤中的胞外DNA与所添加的胞内DNA相比近乎可以忽略，因此可以认为总DNA提取近似反映了活体原核生物群落。
研究发现，DNase预消化和PMA处理均显著低估了16S rRNA基因拷贝数（图5A）。此外，除碱性缓冲液洗涤外，所有方法都会导致活体原核生物群落结构发生显著改变（图5B–D和S11）。例如，PMA处理显著高估了埃希氏菌属（Escherichia）的比例，而低估了芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）的比例（图5C）。DNase预消化显著低估了副球菌属（Paracoccus）的相对多度，而DNA酶消化和rRNA直接表征都显著高估了链霉菌属（Streptomyces）的比例。进一步分析表明，碱性缓冲液洗涤的群落结构解析准确率最高（94.9%），显著优于DNase预消化（87.8%）、PMA处理（85.1%）及rRNA直接表征（82.2%）（图5D）。此外，本研究还探讨了各个方法所表征原核生物群落与总群落的相似性与环境因子的关系，这用于反映不同方法的准确性。例如，PMA处理所表征的相似性与土壤总钾含量呈正相关，与砂粒含量呈负相关；rRNA直接表征的相似性与G+/G-比率（革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌）呈正相关，与黏粒含量呈负相关。另外，碱性缓冲液洗涤表征的相似性与土壤pH值呈负相关（图S12）。
图5.不同核酸提取方法所表征的模拟微生物类群的多度和群落结构（A）土壤16S rRNA基因拷贝数；（B）模拟土壤微生物群落的结构；（C）总微生物和活体微生物类群的相对多度差异，差异通过t检验揭示；（D）总DNA提取和不同土壤活体微生物研究方法所表征模拟群落结构的相似性。Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理；rRNA：rRNA直接表征。
不同方法对土壤胞外DNA的去除效率所有胞内DNA提取方法都能去除土壤中80%以上的游离标签胞外DNA，但去除效率差异很大（图6和表S4）。其中，DNase预消化法的去除效率最高，在森林土壤和草地土壤中分别达到99.45%（SD=0.33%，CV=0.33%）和99.86%（SD=0.08%，CV=0.08%）。在森林和草地土壤中，PMA处理的平均去除率也分别达到了91.69%（SD=10.12%，CV=11.04%）和88.04%（SD=19.23%，CV=23.51%），但森林土壤重复间的变异性较大。在所有评估方法中，碱性缓冲液洗涤法的去除率最低，在森林土壤和草地土壤中的去除率分别为85.84%（SD=8.80%，CV=10.24%）和81.94%（SD=9.23%，CV=11.44%）。
图6.基于不同核酸提取方法的标签胞外DNA拷贝数和去除效率（A）森林生态系统中不同核酸提取方法下标签胞外DNA的拷贝数；（B）森林生态系统中不同核酸提取方法下标签胞外DNA的去除率；（C）草原生态系统中不同核试验提取方法下标签胞外DNA的拷贝数；（D）草原生态系统中不同核酸提取方法下标签胞外DNA的去除率。Total：总DNA提取；DNase：DNase预消化；ABW：碱性缓冲液洗涤；PMA：叠氮溴化丙锭（PMA）处理。
方法
研究地点与土壤采样
土壤样本采集自中国西部的52个地点，涵盖云南、四川、西藏、青海和新疆等多个省份（图S13）。研究区域包括多种生态系统类型，如高寒草甸、高寒草原、沙漠、灌木丛、杉木林、针叶林和农田（表S5）。研究区域的气候和地形也具有高度异质性，采样点的海拔、年均温（MAT）和年均降水量（MAP）分别为421~4618 m、-6.04~21.83℃和40.7~1565.1 mm。这种高度异质性确保了本研究结果的普适性。此外，大部分研究地点的气候干燥和寒冷，凸显了胞外DNA在影响土壤活体原核生物群落分析中的重要性。
在每个研究地点，记录了包括生态系统类型、优势植物、地理坐标、海拔和坡度在内的基本信息，并拍摄了采样点周围环境的照片。随后，随机选择5个子采样点，最小间隔距离为10 m。采集每个点0~10 cm的土壤样本，充分混合后，通过2 mm筛网。用于总DNA和胞内DNA提取，以及无机氮、水分含量测定的土壤样本保存在4℃的冰箱中。用于RNA提取的土壤则保存在液氮中。此外，另一份子样本风干后用于测定pH值及总有机碳、总氮、总磷、总钾和有效磷的含量。每个采样点的MAT和MAP数据来自WorldClim数据库。土壤类型基于联合国粮农组织和维也纳国际应用系统分析研究所建立的世界土壤数据库HWSD2.0提取。
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