研究简介
本文研究了通过工程化天然弧菌（Vibrio natriegens）来实现对复杂有机污染物的生物修复。工业废水、石油污染和塑料污染对全球海洋生物安全构成重大威胁，因为这些污染物具有毒性、致突变性和持久性。微生物在生物修复中的应用受到有机污染物复杂性和耐盐性限制。研究人员利用合成生物学技术，将天然弧菌（Vibrio natriegens）工程化，使其能够生物修复含盐废水和土壤中的复杂有机污染物。研究团队通过插入自然转化能力主调控基因tfoX到V.natriegens菌株Vmax的染色体1中，并过表达以增强DNA摄取和整合能力。通过化学合成和酵母组装了五个降解基因簇（总43 kb），并开发了一种基于Vmax的迭代自然转化方法（INTIMATE），将这些基因簇转移到Vmax中。
这些基因簇能够降解单环和多环芳烃，包括苯酚、萘、联苯、二苯并呋喃和甲苯等有机污染物。通过在不同盐度条件下培养Vmax，并添加有机污染物，验证了基因簇的功能。结果显示，Vmax在高盐条件下对有机污染物的耐受性优于其他菌株。通过转录组分析，发现多个与有机污染物外排相关的基因表达上调。通过自然转化方法，成功将tfoX基因插入Vmax基因组，并优化了自然转化效率。通过筛选，确定了chr2_297位点作为基因簇插入的最佳位置。最终构建了一个能够同时降解五种有机污染物的V.natriegens菌株VCOD-15。在含有多种有机污染物的工业废水中，VCOD-15能够同时降解联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯。在48小时内，VCOD-15能够去除98.9%的联苯、98.5%的苯酚、99.6%的萘、99.7%的二苯并呋喃和97.7%的甲苯。在含有有机污染物的盐碱土壤中，VCOD-15也能够降解联苯、苯酚、萘和二苯并呋喃。
通过HRGC-MS分析，检测到了稳定同位素标记的中间代谢产物，证实了VCOD-15在土壤中的降解能力。文章讨论了VCOD-15的局限性，包括在低盐环境中的生长能力不如P.putida和B.xenovorans，以及不能完全矿化污染物或使用它们作为碳源。提出了通过引入代谢基因簇来解决这些限制的可能性，并探讨了将基因簇设计和插入策略应用于其他降解菌株的可能性，如P.putida KT2440。此外，还讨论了通过适应性实验室进化来提高这些菌株的鲁棒性、耐受性和修复效率的可能性。本研究展示了通过工程化的V.natriegens菌株VCOD-15，能够有效降解复杂有机污染物，为处理含盐废水和土壤中的有机污染物提供了一种新的生物修复方法。通过进一步的基因工程和适应性进化，有望进一步提高这些工程菌株的性能，以应对更广泛的环境挑战。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
使用Bioscreen C仪器测量细菌菌株的生长曲线。通过在30°C的LB培养基中以1：100的比例传代培养过夜细菌培养物，菌株生长至对数期（OD600为0.4–0.5），并重悬于相应的培养基中，然后将5μl这种标准化的细菌悬浮液接种到100μl所需的生长培养基（LB1/4、LB、LB3、LB5、LB7、NSS和M9）一式三份。将板在30°C下孵育，隔夜每小时测量一次OD600，同时连续高速振荡。通过测量OD600值来评估菌株的生长情况，从而比较不同菌株在不同培养基中的生长能力。Bioscreen C全自动生长曲线分析仪通过连续监测OD600值，能够实时了解菌株的生长动态，包括生长速率、最大生物量等关键参数，提供了直观的生长曲线图，帮助研究人员更直观地比较不同菌株的生长差异，从而更好地理解菌株的生长特性和适应性。
实验结果
通过工程化的天然弧菌（Vibrio natriegens）菌株VCOD-15，成功实现了对复杂有机污染物的生物修复。通过插入自然转化能力主调控基因tfoX到V.natriegens菌株Vmax的染色体1中，并过表达以增强DNA摄取和整合能力。化学合成和酵母组装了五个降解基因簇（总43 kb），并开发了一种基于Vmax的迭代自然转化方法（INTIMATE），将这些基因簇转移到Vmax中。成功构建了能够同时降解五种有机污染物（联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯）的V.natriegens菌株VCOD-15。在实验室条件下，VCOD-15能够同时降解多种有机污染物。在48小时内，VCOD-15能够去除98.9%的联苯、98.5%的苯酚、99.6%的萘、99.7%的二苯并呋喃和97.7%的甲苯。在含有多种有机污染物的工业废水中，VCOD-15表现出高效的降解能力，优于其他自然降解菌株。通过生物修复技术，VCOD-15能够有效降解复杂有机污染物，为处理含盐废水和土壤中的有机污染物提供了一种新的方法。
图1、a)总结复杂有机污染物修复菌株开发的示意图。b）V.natriegens Vmax，恶臭假单胞菌KT2440，异形鞘伯克霍尔德菌LB400的V.生物量（OD600），和鞘氨醇单SHPJ-2网格上方的灰色条表示培养菌株的七种培养基，含有胰蛋白胨和酵母提取物作为碳和氮源的培养基，具有不同盐度（LB1/4、LB、LB3、LB5和LB7）和两种添加甘油和NH4Cl的盐溶液作为唯一的氮和碳源（M9和NSS）。
图2、a）含有污染物（分别为联苯、苯酚、萘、DBF和甲苯）的LB1/4、LB、LB3和LB5培养基中的候选菌株生长速率。气泡大小表示最大生物量（OD600）与培养时间（h）的比率。b）描述tfoX插入安排的示意图。将lac纵子插入V的int位点。纳特里根ATCC 14048生成V。纳特里根Vmax的。受诱导型启动子PT7调控的tfoX基因插入chr的int位点。Vmax的1个，DdRp的下游和rsmE的上游。c）使用0.5–400 ng p15A质粒进行自然转化的VCOD-2转化测定。d）使用染色体中0.5–400 ngΔwbfF：：CmR（3 kb/3 kb）供体DNA进行VCOD-2转化测定，自然转化。e）使用5 ngΔwbfF：：CmR供体DNA进行VCOD-2转化测定，该供体DNA含有指定的自然转化同源侧翼。f）菌株Vmax、VCOD-1和VCOD-2在LB3培养基中的生长，以OD600测量。g）选择作为CHR上候选插入位点的12个中性位点的分布。Vmax的2。h）通过自然转化插入12个位点的表达sfGFP的细胞的荧光。i，使用2 kb侧翼同源片段和sfgfp供体DNA表征12个位点的重组效率。
图3、不同菌株（Vmax、SHPJ-2、LB400和KT2440）在含有联苯（BP）、苯酚、萘（NAP）、二苯并呋喃（DBF）和甲苯的LB1/4培养基中生长曲线。所有菌株在30℃下培养。芳香污染物浓度梯度设置为：0.5 mM、1 mM、3 mM、5 mM、10 mM。统计分析：数据用3个生物重复的平均值±SD表示。
图4、通过VCOD-15和基因表达水平检查复杂有机污染物的修复。a，插入VCOD-15染色体的基因簇的示意图（VmaxΔint：：tfoXΔchr2_297：：bphA1234BCKHJID：：dmpLMNOP：nahAabcdBFCYED：：dbfA1234BC：：xylABCMN）。将五个基因簇（bph、dmp、no、dbf和xyl）依次插入中性位点chr2_297。氯霉素抗性基因CmR显示为深绿色箭头。连接基因簇的长度为43 kb。b，对工程V中复杂污染物降解基（c，联苯;d，苯酚;e，萘;f，DBF;g，甲苯）。彩色（VCOD-15）和灰色（Vmax）点反映污染物浓度（左y轴）。彩色（VCOD-15）和灰色（Vmax）条形表示污染物的残留数量（右y轴）。h，菌株VCOD-2和VCOD-15在LB3培养基中的生长测量为OD600。
图5、VCOD-15对活性污泥生物反应器中复杂污染工业废水样品的生物修复。a)钠工业废水样品中的Vmax、鞘氨醇单胞菌属SHPJ-2、B.xenovorans LB400和P.putida KT2440的生长曲线，测量为OD600。菌株在废水样品BZ I（a）和DL I（b）中培养，加入10 g l-1酵母提取物和相应浓度的污染物（如面板上方的灰色条所示）在30°C下振荡。c，d)菌株的联苯修复效率Vmax菌株、VCOD-15菌株、P.putida B6-2菌株和工业废水样品BZ I(c)和DL I(d)中的B.xenovorans LB400（c）和DL I（d）e)用于修复工业废水样品中复杂有机污染物的活性污泥生物反应器示意图。f–j，复杂有机污染物。f，联苯;g，苯酚;h，萘;i，二苯并呋喃;J，甲苯）在工业废水样品中VCOD-15的修复效率，在e中所示的活性污泥生物反应器中进行。统计分析：数据表示为三个生物学一式三份的平均值±s.d.（a，b）。数据表示为三个独立实验（c，d）的平均值±s.d.。使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验评估统计显著性。数据表示为s.d.（f-j）三个生物学一式三份±平均值。
总结
工业废水、石油污染和塑料污染因其毒性、致突变性和持久性而成为全球海洋生物安全的重大威胁1。微生物在生物修复中的使用受到有机污染物复杂性和对盐水胁迫的有限耐受性的限制。在这项研究中，研究人员使用了合成生物学将Vibrio natriegens改造成一种能够生物修复盐废水和土壤中复杂有机污染物的菌株。能力主调节基因tfoX入V的1号染色体中。natriegens菌株Vmax并过表达以增强DNA摄取和整合。降解基因簇在酵母中化学合成和组装。开发了一种基因组工程方法（基于Vmax的迭代自然转化，具有扩增的tfoX效应）将五个基因簇（总共43 kb）转移到Vmax中。该工程菌株能够生物修复氯碱厂和炼油厂的工业废水样品中的五种有机污染物（联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯），涵盖从单环化合物到多环化合物的广泛底物范围。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪精确地测量细菌在不同培养基中的生长曲线，通过监测V.natriegens Vmax在不同盐度条件下的生长曲线，研究团队发现Vmax在高盐环境中对有机污染物具有较高的耐受性。通过获得生长曲线数据图，能够优化实验设计，更高效地进行菌株筛选和生长条件优化，选择最适合的菌株和培养条件进行后续的基因工程和生物修复实验。为后续的基因工程和生物修复实验奠定了坚实的基础。本研究展示了通过工程化的V.natriegens菌株VCOD-15，能够有效降解复杂有机污染物，为处理含盐废水和土壤中的有机污染物提供了一种新的生物修复方法。通过进一步的基因工程和适应性进化，有望进一步提高这些工程菌株的性能，以应对更广泛的环境挑战。