研究简介
本研究以I型食源性致病菌肉毒梭菌（Clostridium botulinum）ATCC 3502为对象，系统评估三个冷休克蛋白基因cspA、cspB、cspC在氯化钠、pH及乙醇三类食品加工相关胁迫下的生物学功能，并首次报道它们对运动性与鞭毛形成的影响。研究采用插入失活突变株与野生型同步比较，利用Bioscreen C厌氧微孔板连续记录48 h生长曲线，按Baranyi模型提取最大生长速率（ODU/h）和迟滞期（h），结合0.3%半固体琼脂游动实验及透射电镜观察鞭毛表型。结果表明cspB缺失导致全部NaCl浓度（1–4%）下最大生长速率显著降低，cspC缺失显著延长迟滞期，提示cspB为盐胁迫普遍调控因子，cspC主要参与快速适应。在pH 5.5–8.0范围，cspB与cspC突变株均表现生长削弱，cspA缺失反而缩短迟滞期，显示cspA可能负向调控酸-碱适应；乙醇胁迫（1–5%）下，cspB突变株生长速率全面下降，cspC突变株迟滞期显著延长，而cspA突变株生长优于野生型，证实cspB/C对膜-蛋白完整性保护至关重要。运动性检测（37℃与20℃）显示cspA与cspC突变株游动直径显著减小，电镜下两者鞭毛缺失，cspB突变株鞭毛正常但游动略减，表明cspA/C为鞭毛形成必需，cspB主要通过代谢适应间接影响运动。cspB在肉毒梭菌中充当多重胁迫共同调控枢纽，cspC特化于快速应激与鞭毛发生，cspA则负向调控生长却正向控制运动。该发现拓展了对冷休克蛋白非低温功能的认知，为靶向csp基因设计新型抑菌策略、控制肉毒梭菌在微加工食品中的存活与传播提供了理论依据。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪被用于监测枯草芽孢杆菌孢子发芽及后续营养生长的过程。将300μL的枯草芽孢杆菌孢子悬液加入到300μL的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中，初始OD600设置为1.0。将混合液加入到Bioscreen C的微孔板中，微孔板在30℃下培养48小时。每5分钟自动监测一次OD600，每次测量前微孔板会摇动10秒，以防止孢子沉降。每种条件和阴性对照设三个重复孔，实验至少重复三次，以确保数据的可靠性。通过Bioscreen C记录的OD600数据，可以分析孢子发芽及后续营养生长的动力学变化。
实验结果
cspB和cspC是肉毒梭菌应对多种非低温胁迫的关键基因。cspB缺失显著降低所有NaCl和乙醇浓度下的最大生长速率，并在低pH下延长迟滞期，表明其具有广谱胁迫保护功能。cspC缺失主要导致迟滞期显著延长，提示其参与快速适应启动，而非持续生长过程。cspA对胁迫生长无正向作用，反而可能负调控生长。在NaCl、pH和乙醇条件下，cspA突变株的生长速率等于或优于野生型，但其运动性与鞭毛形成显著受损，表明cspA的功能主要体现在运动调控而非胁迫耐受。cspC与cspA共同调控鞭毛形成与运动性。电镜与半固体培养结果显示，仅cspA和cspC突变株完全丧失鞭毛，并在37℃与20℃下运动性严重下降。Csp蛋白在肉毒梭菌中具有分工明确的“多功能”角色。
图1.C.botulinum ATCC 3502及其csp突变株在1.0–4.0%NaCl条件下的生长曲线。350µL 1:100稀释的过夜培养液在37°C厌氧环境下于Bioscreen C全自动生长曲线分析仪中培养，自动测量OD₆₀₀，每15分钟一次。误差线表示三次生物重复的最高与最低值。
图2、C.botulinum ATCC 3502及其csp突变株在pH 5.5–8.0条件下的生长曲线。
图3.C.botulinum ATCC 3502及其csp突变株在1.0–5.0%（wt/vol）乙醇条件下的生长曲线。
图4、C.botulinum ATCC 3502及其csp突变株的运动性测试。（A）37°C，（B）20°C。1：ATCC 3502；2：cspA突变株；3：cspB突变株；4：cspC突变株。
图5、C.botulinum ATCC 3502及其csp突变株在37°C和20°C下的电子显微照片。cspA与cspC突变株鞭毛形成受限。(A)37°C；(B)20°C。1：ATCC 3502；2：cspA突变株；3：cspB突变株；4：cspC突变株。
总结
肉毒梭菌（Clostridium botulinum）是一种重要的食源性病原菌，因其能产生肉毒神经毒素而导致肉毒中毒。C.botulinum能够在多种应激条件和食品加工过程中适应并存活。冷休克蛋白编码基因（csp）已知与低温下的生长有关，但它们可能还具有其他功能。在本研究的突变分析中，研究发现cspB和cspC（而非cspA）对C.botulinum ATCC 3502的NaCl、pH和乙醇胁迫反应以及运动性具有重要作用。在所有测试的NaCl浓度下，cspB突变株的最大生长速率较低，而cspB和cspC突变株的迟滞期均比野生型菌株更长。在低pH条件下，cspB和cspC突变株的最大生长速率较低或迟滞期较长。在所有测试的乙醇浓度下，cspB突变株的最大生长速率较低，而cspC突变株的迟滞期较长。运动性在cspA和cspC突变株中均降低，鞭毛形成受到影响。结果表明，cspB在应激反应中起普遍作用，而cspC则帮助C.botulinum应对NaCl、pH和乙醇胁迫。Bioscreen C全自动生长曲线分析仪被用于“2.2 NaCl、pH和乙醇胁迫条件下ATCC 3502野生型与csp突变株的生长特性”这一核心实验设计。该设备承担了“高通量、高精度、厌氧兼容”的生长表型定量任务，一次性并行监测96×3组胁迫条件，替代传统试管法，显著节省耗材与人力。15 min间隔的连续OD记录避免了人工取样造成的厌氧干扰与时间点遗漏，保证曲线分辨率。内置振荡与恒温功能，使NaCl、pH、乙醇梯度实验在完全一致的厌氧环境下完成，消除环境波动带来的误差。输出的高保真OD–时间数据是后续模型拟合与统计学检验的唯一依据，直接支撑了“cspB普遍调控胁迫生长、cspC主要延长迟滞期”这一核心结论。本研究首次阐明csp基因家族在肉毒梭菌非低温胁迫适应与运动中的差异化功能，为靶向冷休克蛋白设计新型抑菌策略、控制肉毒梭菌在微加工食品中的存活与传播提供了理论依据与分子靶点。
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