生物膜形成和定量。 使用先前描述的方法在聚苯乙烯表面测定所有菌株的生物膜形成。为了便于定量和显微镜检查，使用96孔和24孔聚苯乙烯微孔板培养生物膜。通过将5μl过夜培养物的悬浮细胞接种到96孔微孔板单个孔中的300 ul SDM培养基中，或将25μl细胞悬浮液接种到24孔板中2 ml SDM培养基中来启动生物膜的生长。然后将微孔板在37°C、5% CO₂条件下静置培养16小时。孵育后，移除液体培养基，并用无菌蒸馏水冲洗孔一次。将板（96孔）风干，并用0.1% 的沙黄染色10分钟。染色后，用蒸馏水冲洗板以去除多余的染料，并风干3小时。通过使用酶联免疫吸附测定微孔板读数器（型号3550；Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.）测量染色生物膜在490 nm处的吸光度来定量生物膜。每个测定进行三次重复，无生物膜的孔在沙黄染色后用作空白对照。在24孔板中形成的生物膜在去除浮游细胞后、染色前立即拍照。
粘附测定。 测定菌株粘附到粘蛋白包被的聚苯乙烯表面的能力，以确定单个基因失活对初始粘附的影响。聚苯乙烯微孔板的表面首先用2 ml 1% 的猪胃粘蛋白（III型；Sigma）在粘附缓冲液（10 mM KPO₄, 50 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0.1 mM MgCl₂, pH 7.0）中预处理。将板在室温下轻轻摇动孵育2小时，移除多余的粘蛋白溶液后风干。然后通过加入2 ml预先制备的静息细胞悬浮液（密度为10⁸ 细胞/ml）开始粘附。静息细胞通过离心过夜培养物制备，洗涤两次，并重悬于粘附缓冲液中。将板在37°C下轻轻摇动孵育2小时。孵育后，移除未粘附的细胞，并通过轻微超声处理将粘附细胞解离到2 ml缓冲液中。对粘附和非粘附细胞进行活菌落计数以确定粘附细胞的百分比。
酸耐受性测定。 首先通过评估在pH 5.0和7.0的THYE琼脂平板上的生长来评估pH对hk11和rr11缺失突变体的影响。将突变体和亲本菌株在THYE肉汤（pH 7.0）中过夜培养。将一份过夜培养物转移到九份新鲜培养基中，并在37°C、5% CO₂气氛中继续培养2小时。在用于10 mM KPO₄缓冲液（pH 7.2）进行系列稀释之前，将培养物轻轻超声处理15秒以分散细胞链。将每种菌株的细胞悬浮液等分试样（20μl）接种到pH 5.0和pH 7.0的THYE琼脂平板上。然后将板在37°C、5% CO₂气氛中孵育40小时，然后评估酸敏感性。通过在pH 5.0的THYE平板上培养40小时后比较亲本和突变体的生长来确定对低pH的敏感性。
还在肉汤中培养菌株，通过先前描述的方法测定可诱导的ATR。所有ATR实验在补充了20 mM葡萄糖的TYE培养基（使用40 mM磷酸-柠檬酸盐缓冲液制备，pH分别为7.5、5.5和3.5）中进行。简而言之，通过将1体积过夜培养物转移到9体积（1:10）新鲜TYEG（pH 7.5）中，并在37°C、5% CO₂气氛中培养2小时来制备对数中期细胞。这些细胞通过在10,000 x g下离心10分钟收集，并重悬于2 ml新鲜TYEG（pH 5.5）中，浊度为0.6（A600）。通过在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时来诱导细胞进行酸适应。然后将适应的对数期细胞暴露于预确定的致死pH 3.5（通过将未适应的对数中期细胞在pH值从6.0到2.0的TYEG中培养3小时来确定）。立即从每个样品中取一份细胞悬浮液以确定零时的总活细胞数，并将培养物在37°C、5% CO₂条件下孵育3小时。孵育后，取一份细胞悬浮液通过活菌计数确定存活百分比。ATR表示为在致死pH下存活3小时的细胞百分比。
酸适应期间细胞的¹⁴C标记。 通过将细胞暴露于¹⁴C标记的氨基酸，然后进行蛋白质提取和二维凝胶电泳分离，来评估NG8和SMHK11在酸适应过程中蛋白质表达的变化。将NG8和SMHK11的三个独立培养物在由六种氨基酸（谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸和天冬酰胺）、40 mM磷酸-柠檬酸盐缓冲液（pH 7.5）和20 mM葡萄糖组成的最小培养基中培养。将细胞培养至指数生长中期（600 nm处光密度= 0.7），在不含葡萄糖和缓冲液的培养基中洗涤两次，并重悬于2.5 ml新鲜最小培养基中，浓度为2 x 10⁸ 细胞/ml。将每个菌株的三份培养物分成两部分，一部分暴露于pH 5.5，另一部分保持在pH 7.5，并存在150μCi的¹⁴C-氨基酸混合物。在37°C下孵育30分钟，通过向每个管中加入2 mg氯霉素停止蛋白质合成。离心细胞（15,000 xg，10分钟）并洗涤（使用10 mM Tris-HCl, pH 6.8，含1 mM EDTA和5 mM MgSO₄）。将细胞储存在-20°C，并使用超声处理（在玻璃珠存在下）制备用于二维凝胶电泳的细胞蛋白提取物，如先前所述。
二维凝胶电泳和蛋白质图谱图像分析。 二维凝胶电泳和放射自显影图像分析采用先前描述的方法进行。第一维等电聚焦在线性pH 4至7的18厘米固定化pH梯度凝胶条上进行，上样量为10⁶ cpm，对应于150μg细胞蛋白。第二维分离使用14%聚丙烯酰胺梯度凝胶（185 x 200 x 1.0 mm）进行，干燥的凝胶暴露于X射线胶片14天。放射自显影上可视化的蛋白质使用Bio Image软件（版本6.1）在Sun Sparc工作站上进行分析。如果酸暴露细胞（pH 5.5）与对照细胞（pH 7.5）相比，相对积分光强度变化超过两倍，则将该蛋白质点分类为差异表达。进行了三次独立实验；对每个点计算了变异系数；那些表现出高固有表达变异的蛋白质被排除为酸应激蛋白。
显微镜检查。 为了通过扫描电子显微镜检查生物膜的空间分布和结构，将聚苯乙烯微孔板表面形成的生物膜用10 mM磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，通过加入2 ml 3.7%甲醛（溶于10 mM磷酸盐缓冲盐水）固定，并在室温下孵育24小时。然后通过一系列乙醇冲洗（30%、50%、70%、95%和100%）对样品进行脱水，并用液态CO₂进行临界点干燥。将孔底表面切下，安装并进行金溅射镀膜。然后使用扫描电子显微镜（型号S-2500；Hitachi Instruments, San Jose, Calif.）检查样品。
我们之前观察到，变形链球菌中由comC基因编码的CSP激活了一个未表征的第二途径，该途径似乎与细胞分离或链形成有关。由CSP激活的第二途径仍有待确定。为了测试由hk/rr11编码的TCSTS是否可能是第二途径，我们通过光学显微镜比较了在添加或不添加CSP的情况下，hk/rr11突变体在生物膜中形成的链长度。简而言之，使用先前描述的方法在微孔板中培养突变体生物膜，不同之处在于每个孔含有一个灭菌的盖玻片作为底物，并且培养物补充了1.0μg/ml新鲜CSP。生物膜在SDM培养基中生长16小时，然后移除液体。然后将生物膜用0.1%结晶紫染色1分钟，然后放在显微镜载玻片上。然后通过光学显微镜（Olympus CH30RF100; Tokyo, Japan）观察生物膜并定性评估细胞链长度。
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