1.2.3 CA活性检测
CA活性检测参照刘璐等的方法，略作改进。采用酶标仪在400 nm处检测对硝基苯酚（p-NP）浓度，并作其随时间变化曲线，计算CA活性。①绘制对硝基苯酚标准曲线；②工作液的制备：0.02 mmol/L乙酸对硝基苯酯（p-NPA）溶于1 mL无水乙醇，0.02 mmol/L二乙基丙二酸溶于9 mL磷酸缓冲溶液，将两者混合均匀；③粗酶液制备：取5 mL菌悬液10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释2倍后，与工作液1:1混合，制成胞外CA酶液；取5 mL菌悬液与1 mL B-PER™Bacterial Cell Lysis Reagents混合均匀，静置30 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液稀释2倍后，与工作液1:1混合，制成总CA酶液；④酶活性检测：将粗酶液放入酶标检测盒中，25℃反应3 min后测定OD₄₀₀；⑤利用标准曲线求出生成p-NP的浓度，计算CA活性。酶活性定义：每毫升每分钟内生成1μmol p-NP所需的酶量，单位：U/mL。
1.2.4培养基初始pH对B.safensis生长及其产CA的影响
用5 mol/L NaOH溶液与1 mol/L HCl溶液调节液体培养基初始pH值分别至6.0、7.0、8.0、9.0。以2%（体积分数，下同）的接种量将菌悬液（OD₆₀₀=0.5）接至100 mL液体培养基中，置于30℃、150 r/min的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD₆₀₀，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。
1.2.5接种量对B.safensis生长及其产CA的影响
以1%、2%、4%、8%的接种量分别将菌悬液接至100 mL液体培养基（pH=7.0）中，置于30℃、150 r/min的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD₆₀₀，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。
1.2.6温度对B.safensis生长及其产CA的影响
以2%的接种量将菌悬液接至100 mL液体培养基（pH=7.0）中，分别置于20、25、30、35、40、45、50和60℃、150 r/min的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD₆₀₀，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。
1.2.7转速对B.safensis生长及其产CA的影响
以2%的接种量将菌悬液接至100 mL液体培养基（pH=7.0）中，分别置于120、150、180 r/min、45℃的恒温摇床中培养。分别于4、8、12、24、36、60、84 h检测菌液OD₆₀₀，12、24、36、60、84 h检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。
1.2.8金属离子对B.safensis生长及其产CA的影响
设定Zn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子浓度梯度为0.005、0.010、0.020 mmol/L。以2%的接种量将菌悬液接入含不同浓度金属离子的100 mL液体培养基（pH=7.0）中，置于150 r/min、45℃的恒温摇床中培养60 h后检测CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。
1.2.9最佳培养条件下B.safensis生长及其产CA特性
以2%的接种量将菌悬液接至100 mL含0.010 mmol/L Mn²⁺的液体培养基（pH=7.0）中，置于150 r/min、45℃的恒温摇床中培养。定期取样检测菌液OD₆₀₀和CA活性。每组实验设3个平行样，结果取平均值。
2结果与分析
2.1对硝基苯酚标准曲线的绘制
配制不同浓度p-NP溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L），在波长400 nm下测定其吸光度，结果见图1。
图1对硝基苯酚标准曲线图
2.2培养基初始pH对B.safensis生长及其产CA的影响
不同初始pH条件下，B.safensis生长及其产CA活性变化如图2所示。初始pH在6.0~9.0范围内，其对细菌生长几乎无影响，说明该菌株对弱酸和弱碱性环境均有一定的耐受性。初始pH值为7.0时，菌液OD₆₀₀值最高，为3.97。初始pH对CA活性的影响较为明显。在不同初始pH条件下，CA活性均随着培养时间延长呈先增长后降低的趋势，并在60 h左右达到峰值，其中初始pH值为7.0时酶活最高，为0.182 U/mL。Zheng等报道，初始pH值为8.0时，胶冻样芽胞杆菌产CA的活性最高，但在7.0~9.0范围内，酶活变化不大。本研究表明，B.safensis产CA最适的初始pH值为7.0，这可能与细菌种类、培养基组份不同而导致培养后期pH值存在差异有关。
图2培养基初始pH对B.safensis生长与CA活性的影响
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