摘要
目的小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)是耶尔森氏菌病(yersiniosis)的主要致病因子，是全球最重要的食源性致病菌之一。本研究的目的在于分离、鉴定其烈性噬菌体，并探讨噬菌体的应用潜力。
方法以Yersinia enterocolitica CICC 10869为指示宿主，采用双层琼脂平板法从浙江省宁波市北仑区路林市场下水道中分离得到一株烈性噬菌体Yersinia phage Yen-yong1(简称Yen-yong1)，对其进行形态学观察、宿主范围测定、全基因组测序、基因功能注释、系统进化地位分析、理化耐受性测定以及生物被膜去除能力测定，并检测其对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除作用。
结果Yen-yong1可在1.5 h内使菌液裂解澄清。透射电镜下，Yen-yong1呈长尾病毒样(Siphovirus-like)，椭圆形头部长(83.32±0.15)nm、宽(59.57±2.28)nm；尾长(168.04±3.21)nm。Yen-yong1的dsDNA基因组全长51 321 bp，G+C含量为47.80%，包含93个开放阅读框(open reading frames,ORFs)，且不含影响应用的溶原、耐药或毒力因子基因。Yen-yong1与公共数据库中的其他噬菌体基因组间的最高核苷酸序列相似度低至20.64%，远低于属界限值(70.00%)；与其他噬菌体间共享的核心基因(core gene)占比最高值仅为20.00%，小于亚科阈值(27.00%-79.00%)。Yen-yong1在有尾纲(Caudoviricetes)中代表一个新的属和亚科。Yen-yong1具有种特异性，仅裂解小肠结肠炎耶尔森氏菌，在4株供试小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中可裂解3株。Yen-yong1在-80-60℃、pH 2.0-13.0、0-3%氯化钠的胁迫下均保持高水平的溶菌活性。此外，Yen-yong1能够破坏细菌生物被膜。在25℃下，当噬菌体与宿主的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100时，Yen-yong1对生猪肉片中小肠结肠炎耶尔森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202株的清除率分别为93.48%、52.77%和43.24%；在4℃下，3株供试菌株均可增殖，而在MOI为100时，Yen-yong1对生猪肉片中CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202株的清除率分别为98.28%、78.35%和96.33%。
结论Yen-yong1代表一个以往未知的进化谱系，其具有优良的生物学特性以及在常温和低温下良好的保鲜潜力。本研究拓宽了对噬菌体的认知，丰富了噬菌体库和基因库，为食源性耶尔森氏菌病的防控奠定了基础。
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)是一种革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的耶尔森氏菌属(Yersinia)，首次发现和命名于20世纪中叶。耶尔森氏菌属由28个种组成，其中鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森氏菌对人类具有致病性。
小肠结肠炎耶尔森氏菌分布广泛，是少数几种能在冷藏温度下生长的肠道致病菌之一，是全球范围内重要的食源性致病菌之一。它在肉类、奶制品、糕饼、蔬菜沙拉、水产品、饮用水、食品加工工人和屠宰场工人中均有检出。除了引起恶心、呕吐、腹泻、发热和腹痛等症状外，它还可能引发回肠炎、阑尾炎、胆囊炎、肠系膜淋巴结炎、反应性关节炎、结节性红斑、脑膜炎、腱鞘炎、小肠梗阻和各种脓肿，甚至可能引发菌血症和败血症，导致死亡。相关病例主要与食用受污染的生猪肉有关。小肠结肠炎耶尔森氏菌对不利条件具有很强的适应性，其显著特征之一是具有较强的耐冷能力(0-4℃)，并且能够在pH 4.2-9.0和高盐环境(7%)中存活。其抗药性和生物被膜特性进一步增加了源头控制的难度。
噬菌体(bacteriophages，简称phages)是特异性靶向感染细菌的病毒，近年来成为研究热点。2023年10月，欧盟颁布了兽用噬菌体产品指南Guideline on Quality,Safety and Efficacy of Veterinary Medicinal Products Specifically Designed for Phage Therapy；2024年，欧洲药品质量管理局(European directorate for the quality of medicines&healthcare,EDQM)正式通过“关于噬菌体治疗药用产品”的新版总章，将噬菌体增列入European Pharmacopoeia。我国噬菌体研究联盟、中国微生物学会医学微生物学与免疫学专业委员会和中国生物工程学会噬菌体技术专委会也发布了预防及治疗用噬菌体质量标准专家共识。近年来，噬菌体的应用案例不断增加。
噬菌体不会影响食品的营养和感官特性，也不会产生有毒有害物质而对人体健康造成影响。作为一种绿色环保、高效安全、特异性高的天然友好型生物控制剂，噬菌体被认为是处理食品生产链病原菌污染的理想选择。近年来，噬菌体在食品安全领域的应用研究得到了各国政策的支持和鼓励，一系列产品已经进入市场。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)已批准噬菌体用作“食品添加剂”，并授予“公认安全”(generally recognized as safe,GRAS)称号。2006年，FDA批准了荷兰Micreos食品安全公司的李斯特菌噬菌体生物控制产品Listex™P100应用于即食肉类和家禽产品，随后针对沙门氏菌、产毒大肠杆菌和肠球菌等食源性致病菌的噬菌体制剂也相继获得FDA的GRAS认证，被批准应用于食品，例如Intralytix公司的沙门氏菌噬菌体产品SalmoFresh™、Phagelux公司的沙门氏菌噬菌体产品、青岛诺安百特生物技术有限公司的沙门氏菌噬菌体产品和Micreos食品安全公司的大肠杆菌噬菌体产品PhageGuard E™等。食品行业噬菌体生物制剂的研发主要集中在对沙门氏菌(Salmonella)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的控制。截至目前，尚未有小肠结肠炎耶尔森氏菌噬菌体获得GRAS认证。
本研究以小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)CICC 10869(简称CICC 10869)为指示菌株，从浙江省宁波市北仑区路林市场下水道采集的表层水样中分离纯化了一株小肠结肠炎耶尔森氏菌烈性噬菌体Yersinia phage Yen-yong1(简称Yen-yong1)。对其进行了形态学观察、基因组序列测定、基因注释、基于全基因组比对的系统进化地位分析、宿主范围分析、增殖特性分析、理化特性分析；检测了其对细菌生物被膜的去除能力；并检测了其在25℃和4℃下对猪肉中污染的小肠结肠炎耶尔森氏菌的清除能力。
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