摘要:里约热内卢大都会区是猫相关孢子丝菌病的高度流行区。本研究旨在评估一例慢性、破坏性播散性孢子丝菌病患者体内连续分离的孢子丝菌分离株的毒力。在五年期间，从皮肤渗出物和骨骼样本中培养了五株孢子丝菌分离株，经分子鉴定均为巴西利亚孢子丝菌。与大蜡螟幼虫中的早期分离株相比，最终的分离株表现出显著更高的毒力。我们得出结论，巴西利亚孢子丝菌具有在体内增强毒力的能力。这一发现对于护理巴西利亚孢子丝菌病患者的临床医生具有重要意义，并表明需要进一步研究以确定慢性疾病期间致病性增强的潜在机制。
引言
孢子丝菌病是一种由孢子丝菌复合体引起的皮下真菌病。分子研究已鉴定出巴西利亚孢子丝菌、球形孢子丝菌、卢里孢子丝菌、墨西哥孢子丝菌、浅白孢子丝菌和申克孢子丝菌（全球最常见的物种）是不同地区孢子丝菌病的病原体。
里约热内卢大都会区是猫相关孢子丝菌病的高度流行区，主要病原体是巴西利亚孢子丝菌。巴西利亚孢子丝菌患者表现为急性、慢性、固定型、淋巴管型、黏膜型、播散型和复发性孢子丝菌病，以及超敏反应表现。在非免疫抑制患者中播散性病例比其他地区和其他物种先前报道的更常见，这可能与受感染猫的多次深度抓伤导致组织中的高接种量有关，也与巴西利亚孢子丝菌相对于其他孢子丝菌物种具有更强的毒力有关。
除了接种量之外，促进巴西利亚孢子丝菌导致频繁和严重疾病的候选因素包括耐热性、酶和其他分子的产生、对氧化应激和抗真菌药物的耐药性。目前，关于巴西利亚孢子丝菌毒力的信息有限。本研究的目的是描述从一例慢性、破坏性播散性孢子丝菌病患者体内连续分离的孢子丝菌分离株毒力增强的演变过程。
病例报告
一名61岁的退休砌砖工，患有糖尿病和高血压，因6年皮肤病变病史被转诊至里约热内卢Evandro Chagas国家传染病研究所传染病皮肤病学实验室。初步诊断后，他接受了5个月的碘化钾治疗，皮肤病变愈合。然而，他主诉膝盖和左腕关节疼痛逐渐加重，至转诊至INI前两年需坐轮椅。转诊至INI前6个月，他注意到皮肤病变复发。
在我们初次检查时，患者四肢有多处疤痕，左腕背侧有一个渗出性小溃疡病变和一个囊性病变（图1A-B）。双膝和左腕关节强直。X光片显示这些关节处有溶骨性病变和硬化（图1C-D）。人类免疫缺陷病毒和人类T淋巴细胞病毒检测为阴性。总淋巴细胞计数为1,470/μL，T CD4+计数为554/μL，均正常。初始T细胞数量相当低（24/μL）。从左腕部皮肤病变培养出孢子丝菌属，通过酶联免疫吸附测定法进行的孢子丝菌病抗体检测为阳性（OD:2.548/Cut-Off:0.605）。
由于他常规药物（卡托普利、氢氯噻嗪和格列本脲）与伊曲康唑存在潜在有害相互作用，他接受了特比萘芬500 mg/天治疗32个月，直至皮肤病变愈合且影像学模式稳定。然而，由于11个月后皮肤病变复发，特比萘芬重新开始使用，并且由于疾病的顽固、复发性质，他目前继续接受这种抗真菌治疗。由于双膝和左腕严重、永久性畸形（经磁共振证实），他仍需坐轮椅。在他的病程中，从左前臂和左膝采集了皮肤样本，以及从左股骨采集了活检样本。
材料与方法
伦理声明
INI/Fiocruz,RJ,Brazil的研究伦理委员会根据协议编号0024.0.009.000-10批准了本研究。
临床标本
在5年期间从患者的病变处采集了五份生物标本。前3份样本（IPEC32742,IPEC33070和IPEC33718，下文分别称为"1"、"2"和"3"）于2007年9月至2008年3月期间通过细针无菌穿刺从左腕部囊性病变采集；第四份样本（IPEC33946，随后称为"4"）来自2008年4月的左股骨活检；第五份样本（IPEC43174，下文称为"5"）来自2012年2月左膝上皮肤的溃疡性结节。分离株储存在-20°C冰箱中含有10%脱脂奶的冻存管中。
孢子丝菌病诊断
所有临床标本均进行常规真菌学检查，包括10%KOH湿片直接镜检和在2%沙氏葡萄糖琼脂和Mycobiotic琼脂上培养。培养物在25°C下孵育，观察4周是否有真菌生长。通过在37°C的脑心浸液琼脂上培养7天转化为酵母样形式来证明双相性。
分子鉴定
使用氯仿/异戊醇方法从分离株的酵母相提取基因组DNA，用于部分β-微管蛋白和几丁质合成酶编码基因的测序，以及如所述进行T3B PCR指纹图谱分析。在T3B PCR指纹图谱中，对照菌株为巴西利亚孢子丝菌(CBS120339)、墨西哥孢子丝菌(MUM11.02)、申克孢子丝菌(ATCC32286)和球形孢子丝菌(IPEC27135)。在测序分析中，使用巴西利亚孢子丝菌(CBS120339)、球形孢子丝菌(FMR8600)、墨西哥孢子丝菌(CBS120341)、浅白孢子丝菌(CBS111110)和申克孢子丝菌(FMR8604)作为NCBI公共Genbank的参考菌株。
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