本研究采用传统平板分离法和酶标仪分光光度法分别检测了细菌和链霉菌对紫外线的耐受性能,并比较分析了两种方法的优缺点。两种方法均能分析微生物的紫外线耐受水平,但传统平板分离法是通过统计菌株经紫外线照射后的存活量来进行判断,而酶标仪分光光度法不能获得菌株的存活量,却可以根据其生长曲线分析存活菌株的增殖水平,进而判断该菌株的紫外线耐受性。两种方法都能获得菌株的耐受性,其结果也存在一定的互补性。
链霉菌经紫外线照射后的活菌数(平板分离法)
本研究结果显示,传统平板分离法检测嗜线虫沙雷氏菌C7-1在紫外线照射下存活率要远低于解淀粉芽胞杆菌20-10,说明菌株C7-1对紫外线更敏感,但这种敏感性在菌株的增殖速度上并没有相应的体现。酶标仪分光光度法检测到菌株C7-1即使经紫外线照射后,其菌株增殖速度和水平也依然高于菌株20-10,这可能是因为菌株C7-1的生长速度本来就比菌株20-10快,虽然经过紫外线照射后的生长速度低于未经紫外线照射的对照,但相对于生长速度较低的菌株20-10,其生长速度依然较高,故其在相同时间的OD值也就比菌株20-10要高。两种方法除了在结果上表现出一定的差异外,在操作上的差异更大。传统平板分离法工作量大、耗时长,且经常会因为对初始活菌体密度判断不准,导致稀释梯度不合理,稀释平板菌落数过高或过低,而需要重做,后者操作简便、快速,且受初始活菌体密度影响小,即便初始活菌体密度很低,也仅影响生长曲线的延滞期,通过延长检测时间即可解决问题并获得理想的生长曲线。同时,因为酶标仪分光光度法操作简便,可通过增加平行,在数据分析时去掉人为因素导致的偏差较大的数据,即可减少平行间的误差,使结果更准确,平板分离法因为操作较复杂,很难再通过增加平行来减少人为误差。因此,若只需分析微生物在不同环境下的耐受水平,则可选择操作简便快速的酶标仪分光光度法,若需要获得微生物在不同环境下的存活量,则可采用传统平板分离法,若为田间应用参考,则可结合两种方法进行评估。
在采用酶标仪分光光度法进行微生物耐性分析时,需要批量培养微生物。本研究采用96孔细胞培养板批量培养不同处理的微生物。为了避免不同样品在高速振荡下产生孔间交叉感染,采用无菌封口膜对每个孔进行封口。但无菌封口膜的使用同样限制了每个小孔中的供氧量,使得好氧菌在培养4~8 h后即进入稳定期或衰亡期。因此,96孔培养板获得的微生物生长曲线与摇瓶培养状态下的微生物生长曲线不一致,对数期时间变短,且稳定期、衰亡期时间提前。这种情况可通过不加封口膜进行缓解。本研究尝试采用96孔板,但不使用封口膜进行菌株20-10和C7-1在不同盐浓度下的培养,发现两株细菌500 r/min培养8 h,平行间标准差基本都保持在10%以下,未见明显的相互污染现象,且由于培养过程未密封,保持自然供氧,菌株的对数期延长,生长曲线更趋向于摇瓶状态下的生长情况(结果未显示)。但无论封口与否,从两株细菌的生长曲线反映其对盐的耐受水平是一致的。
此外,本研究分析了酶标仪分光光度法在检测微生物对pH和盐的耐受水平中的适用性,发现该方法能很好地检测细菌对不同pH和盐浓度的耐受水平,但在进行链霉菌盐耐受试验时,其结果不如细菌理想:生长曲线不如细菌一样呈现典型的S型,且标准误差较大。这可能是因为链霉菌在液体培养后期菌丝体易成团,菌体密度与OD值之间很难呈现线性关系,使得平行间误差较大,且链霉菌孢子悬浮液即便添加吐温-80作分散剂,但其在液体中的分散性依然不如细菌,且接种量少,接种引起的人为和仪器误差较大。因此,该方法虽然能用于链霉菌对不同环境耐受性的检测,但仅限于对链霉菌培养早期生长状态的监测。
总之,直接采用96孔培养板对微生物进行批量培养,结合酶标仪对不同时间的96孔培养板进行吸光度测定,可以在短时间内检测大量菌株的生长性能、增殖活力、生长速率等指标。该方法相对传统平板分离法,减少了大量样本的稀释、涂布和计数,相对于摇瓶培养微生物再进行光密度检测法,减少了多个摇瓶的接种和频繁取样,大大缩减了工作量,且能获得同样准确的结果,对于研究微生物在不同环境因子中的耐受水平、优势菌株的诱变选育、微生物菌株的抗性筛选及活性分析等均是非常快速且有效的方法,具有广泛的适用性,是高通量操作的好帮手。