2.5 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株细胞壁完整性的影响
AKP是一种位于细菌细胞壁和细胞膜之间的酶。当细胞壁完整性被破坏时,AKP就会渗出细胞外,因此可以通过测定菌悬液中的AKP活力来反映细菌细胞壁的完整。如图4所示,液化沙雷氏菌SCB2649菌株在正常情况下,AKP活力在0.24金氏单位/100 mL。分别经0.5、1.0、2.0 MIC SCB2505代谢物处理后,菌悬液中的AKP活力上升至0.504、0.686、0.944金氏单位/100 mL(P<0.05)。可见,随着代谢物浓度上升,细胞壁通透性增加,细胞壁的完整性已被破坏,导致AKP向胞外泄露越多,并呈现明显的梯度依赖关系。革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖是细胞壁的重要成分,能够控制细菌的营养吸收,抵抗外界有害刺激,维持细菌内环境稳定。研究发现,乳酸等有机酸能降解脂多糖,从而破坏细胞壁。因此推测代谢物中的乳酸作用于液化沙雷氏菌的细胞壁,使得细胞壁完整性被破坏,导致胞外AKP活力上升,此推测与2.3节中代谢物主要抑菌物质为乳酸的论述相符。
图4植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株AKP活力的影响
2.6 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌细胞膜完整性的影响
PI是一种膜不透性的荧光染料。当细胞膜的完整性被破坏时,PI能够进入细胞与遗传物质结合,发出红色荧光。因此能够通过荧光显微镜检测PI荧光反映细胞膜的完整性。如图5所示,PI染色后对照组基本无可观测的荧光,0.5 MIC代谢物处理4 h的液化沙雷氏菌组发出零星的红色荧光,而随着代谢物质量浓度升高,红色荧光逐渐增强。当质量浓度为2.0 MIC时,观察到大量的红色荧光,说明经过SCB2505代谢物处理后,液化沙雷氏菌的细胞膜被破坏,导致大量PI进入细胞与遗传物质结合,发出红色荧光。PENG研究发现,植物乳杆菌细菌素能够透化细胞膜,促进细胞膜形成孔洞,使得细胞膜破损以杀死细菌。此外,LINLEY等认为,过氧化氢能够氧化细胞膜的脂质和蛋白质,导致膜结构和功能受损。而乳酸具有亲脂性,能够透过细胞膜进入细菌体内,影响细菌正常代谢,从而影响细胞膜的合成。推测随着代谢物浓度增加,液化沙雷氏菌的细胞壁完整性被破坏,植物乳杆菌SCB2505代谢物中的抑菌物质更好地与液化沙雷氏菌的细胞膜进行作用,最终破坏细胞膜完整性,增大细胞膜通透性。这些能够进一步说明SCB2505代谢物能够破坏细胞膜完整性,进而起到抑菌作用。
图5不同代谢物浓度对液化沙雷氏菌SCB2649菌株细胞膜完整性的影响(荧光显微镜图)
2.7植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌细胞形态的影响
用代谢物处理10 h后的液化沙雷氏菌SCB2649菌株菌体形态如图6所示。对照组(图6-a)菌体形态呈短杆状,表面相对完整,没有明显皱纹和裂纹;经过0.5 MIC代谢物处理后,菌体表面相比对照组略显粗糙(图6-b)。而经过1.0 MIC代谢物处理后,菌体表面褶皱萎缩,凹陷(图6-c),而2.0 MIC处理组菌体与1 MIC处理组相比,其菌体萎缩、干瘪更为明显,部分菌体被溶解(图6-d)。
a-对照组;b-0.5 MIC代谢物处理组;c-1.0 MIC代谢物处理组;d-2.0 MIC代谢物处理组
图6植物乳杆菌SCB2505代谢物对指示菌表面超显微结构的影响
植物乳杆菌SCB2505代谢物浓度较低时,乳酸等有机酸进入液化沙雷氏菌SCB2649菌株,初步解离细胞壁,细菌表面从光滑变得粗糙。而随着代谢物浓度的上升,细胞壁破坏性加深,代谢物中的细菌素、过氧化氢、乳酸进一步破坏细胞膜完整性,细胞内容物渗出导致菌体表面出现凹陷和皱缩的现象发生。表明SCB2505代谢物可以破坏液化沙雷氏菌的细胞壁与细胞膜的完整性,导致胞内物质外泄,菌体皱缩。此结论与上述细胞壁、细胞膜完整性实验结果一致。
3结论
植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌SCB2649菌株具有较好的抑菌活性,乳酸浓度、过氧化氢酶和蛋白酶对于其抑菌活性均具有显著影响,推测抑菌物质是乳酸、细菌素与过氧化氢的复合物。植物乳杆菌SCB2505代谢物通过抑制液化沙雷氏菌生物被膜的合成,破坏其细胞壁和细胞膜的完整性,增加膜的通透性,使胞内物渗出,菌体表面逐渐凹陷皱缩,甚至裂解死亡。但目前的研究没有深入探究植物乳杆菌SCB2505代谢物的物质组成,也无法解释代谢物中有效抑菌成分对于液化沙雷氏菌SCB2649菌株的深层控制机制,后续研究将采用色谱和组学方法,从分子层面探究植物乳杆菌SCB2505代谢物的物质组成和有效抑菌成分,并进一步阐明植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌的抑菌机制。
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