2.5 HRB2019株的增殖与鉴定
CRFK细胞在接种HRB2019株后的24 h开始出现细胞圆缩、聚集、空斑等的疱疹病毒感染导致的典型细胞病变，测得HRB2019株的病毒滴度为1×108.43 TCID50·mL-1。电镜观察CRFK细胞感染HRB2019株的超离后产物，可见明显的疱疹病毒典型形态的病毒粒子，成球形、有囊膜、直径约为200 nm；以FHV-1猫源阳性血清为一抗，FITC标记的山羊抗猫IgG为二抗，对分离病毒株进行IFA鉴定，结果显示，感染HRB2019株的CRFK出现特异性绿色荧光，对照组正常CRFK细胞无荧光；以MOI为0.01的HRB2019株感染CRFK细胞，每隔12 h取细胞上清进行病毒含量检测，绘制的生长曲线显示，病毒接种细胞后12 h开始复制，12~36 h快速增殖，48~72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰，84 h病毒滴度开始下降(图4)。
A.HRB2019分离株电镜观察结果。B.HRB2019分离株的IFA鉴定结果(200×):a.感染HRB2019株的CRFK细胞；b.正常CRFK细胞。C.HRB2019分离株生长动力曲线
图4 HRB2019株鉴定结果
2.6 HRB2019株基因序列分析
将HRB2019株与国内外流行的FHV-1毒株gD基因核酸序列进行核苷酸同源性及遗传进化分析，结果显示，HRB2019株(▲表示)与GenBank收录的国内外猫源FHV-1流行株核苷酸同源性100%，但与一株虎源的广东分离株亲缘关系较远(KJ466150)，核苷酸同源性为99.8%，说明FHV-1的宿主特异性较高(图5)。
图5 HRB2019分离株gD基因系统进化树
3讨论
目前，我国是仅次于美国的宠物犬、猫饲养大国，犬、猫数量位居全球第二。引起猫上呼吸道感染综合征的主要病原微生物包括FHV-1、FCV、衣原体、支气管败血性博代氏杆菌、支原体、呼肠孤病毒等。其中，由FHV-1、FCV引起的病毒性感染占上呼吸道综合征总发病率的85%以上，FHV-1和FCV混合感染也十分常见。牛昊岩等对2018—2019年南京市2 249例宠物猫病例的调查统计显示，传染病占总病例数的14.32%，最常见的为上呼吸道感染，其中，FHV-1和FCV的混合感染占总数的8.33%；李丽景在2020—2021年对西南部分地区FHV-1和FCV的感染情况进行了分子流行病学调查，183份发病猫拭子样本中FHV-1、FCV混合感染率为10.14%。由此可见，FHV-1和FCV的混合感染在猫上呼吸道病中的比例极高，加之宠物医院所使用的诊断试剂在准确性、敏感性等存在不足，常常造成漏诊的现象，给猫上呼吸道病的诊断和防治带来巨大的挑战。
本研究发现，FCV与FHV-1相比，存在明显的生长优势，有FCV存在时，细胞病变速度快、病毒滴度高，会抑制FHV-1在细胞上的复制与增殖，且FCV病毒滴度远高于FHV-1。研究中笔者尝试用鸡胚尿囊膜途径接种病毒、siRNA体外干扰、噬斑纯化、红细胞凝集特性、差异化细胞培养等方法分离FCV与FHV-1，均以失败告终。FCV病毒本身具有高变异的特性，抗血清对非亲本毒株不能表现完全中和活性。故本研究先利用FCV的生长优势分离出FCV，并制备其特异性抗血清，通过血清中和试验摸索能完全中和FCV且FHV-1能病变的血清中和条件。结果发现，在病毒稀释倍数较低的A、B组，FCV抗血清不能完全中和FCV，依然表现为FCV和FHV共存，且FCV具有压倒性生长优势而不能分离出FHV-1；而D组在病毒高稀释倍数条件下，FCV和FHV-1含量过低，其中的FCV被其抗血清完全中和，而FHV-1的含量不足以感染足够数量的细胞发生肉眼可见的病变。最终摸索出最佳血清中和条件为C组，即FCV抗血清与混合毒体积比为8∶1，从而成功中和FCV并分离出FHV-1。在已有的猫呼吸道病原分离鉴定的研究报道中，部分研究者习惯于将病料先接种细胞增殖培养后再进行病原鉴定，这很容易造成无生长优势的病原在培养过程中丢失。按照本研究的病毒分离方法可以很大程度避免在分离混合感染病料时对FHV-1的漏检，提高了FHV-1的分离率，为了解FHV-1的真实感染情况提供了理论依据，为众多动物疫病混合感染的研究提供了技术支撑。
当前国内使用的猫鼻气管炎、杯状病毒、泛白细胞减少症的三联疫苗仍为上世纪80年代研制的进口疫苗，国产猫疫苗还处于研发阶段，因此对猫群中主要传染性病原的分离与研究是重中之重。本文建立的FHV-1、FCV混合感染病毒的分离方法，为FHV-1及FCV的分离提供了新思路，对加快FHV-1病原学、疫苗学、分子生物学研究的步伐起到重要作用，为我国猫疫苗的开发的研究奠定了基础。
4结论
本研究利用血清中和试验从FCV、FHV-1混合感染的病猫拭子中分离出1株FHV-1，经形态学观察、体外培养特性鉴定及gD基因的遗传进化分析，确认该毒株为FHV-1，并命名为HRB2019株。
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