【背景】粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是一种革兰氏阳性兼性厌氧细菌，可以引起菌血症、心内膜炎、牙髓感染和尿路感染等疾病。由于抗生素耐药性日趋严重，噬菌体治疗已成为一种有效针对粪肠球菌感染的替代策略。
【目的】分离针对粪肠球菌的烈性噬菌体，为开发粪肠球菌噬菌体疗法奠定基础。
【方法】分离出针对耐万古霉素粪肠球菌V583的噬菌体A149，通过透射电镜观察噬菌体的形态，测定其最佳感染复数、一步生长曲线及温度和pH稳定性，并进行全基因组测序分析，以阐释该噬菌体的基本生物学特性；测定其裂解谱和体外抑菌曲线，并进一步通过治疗耐万古霉素粪肠球菌肠道感染小鼠模型评价其抗菌性能。
【结果】噬菌体A149的最佳感染复数为0.001，具有短尾噬菌体科(Podoviridae)的典型形态特征。噬菌体A149在较宽的温度范围(20−50℃)稳定存活，60℃滴度略有下降，70℃及以上完全失活；在pH 4.0−10.0范围内稳定存活，在pH 11.0时滴度略有下降，pH低于3.0或高于12.0时完全失活。噬菌体A149潜伏期短(≤5 min)，暴发量高(约912 PFU/cell)，基因组不含抗生素抗性基因和毒力基因，在体外可有效抑制粪肠球菌生长达11 h，对所测试的粪肠球菌具有86.4%的裂解能力(51/59)，在小鼠肠道感染模型中可降低粪肠球菌约1.3个数量级。
【结论】本研究表明噬菌体A149对于治疗粪肠球菌感染具有一定的应用潜力，为开发粪肠球菌噬菌体防控技术奠定了基础。
1、简介
粪肠球菌(Enterococcus faecalis,Efs)是一种革兰氏阳性兼性厌氧细菌，在人和各种动物的肠道中广泛定殖，被认为是一种常见的肠道共生菌。但Efs也可作为机会致病菌，引起菌血症、心内膜炎、尿道和伤口感染等疾病[1-3]。随着抗生素的广泛使用，Efs的耐药性日趋严重，尤其是耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus,VRE)的出现，给临床VRE感染的治疗带来了困难[4]。研究表明肠道内的VRE定殖可能不会引起症状，但可持续存在较长的时间，成为VRE的储存库，具有引起患者和他人感染的巨大风险[5]。因此，开发针对VRE感染的抗生素替代方案迫在眉睫。
噬菌体是一种能够感染并裂解细菌的病毒，可以靶向消灭特定细菌，在治疗耐药菌感染方面具有独特的优势[6]。此外，噬菌体容易获得，杀菌速度快，对真核细胞无害、安全，并且具有与其他抗菌药物如抗生素、抗菌肽等的协同抗菌效应[7-8]，是一种十分有前景的抗生素替代疗法。先前的研究在城市污水、养殖场污水和人类粪便等各种样本中分离出了针对Efs的多种烈性噬菌体，并且在体外和动物模型中表现出较好的抗菌特性[9-11]，证实噬菌体是一种有效的抗菌剂，但噬菌体的裂解特异性决定了在治疗时要进行配型，因此要筛选足够的噬菌体毒株，建立针对特定细菌的噬菌体资源库。本研究分离出一株针对耐万古霉素Efs V583的烈性噬菌体，拟测定其生物学特性，完成全基因组测序并分析，评价其在体外和体内的抗菌能力，以期为开发Efs感染的噬菌体疗法奠定基础。
2、结果与分析
2.1噬菌体A149的分离纯化与透射电镜观察
以耐万古霉素Efs V583为宿主菌从污水样本中分离出一株噬菌体，经过双层平板法对噬菌体进行3−4次纯化后，将其命名为Enterococcus phage A149。如图1A所示，噬菌体A149的噬菌斑边界分明，周围无晕圈。分析透射电镜拍摄的(图1B)，表明噬菌体A149具有典型的短尾噬菌体科(Podoviridae)的特征，头部直径约为46.2 nm，尾部结构长度约28.8 nm。从形态上观察，噬菌体A149归属于有尾噬菌体纲(Caudovirales)中的短尾噬菌体科。
图1噬菌体A149的形态A：噬菌体A149形成的噬斑；B：噬菌体A149透射电镜形态(10 000×)。
2.2噬菌体A149的最佳感染复数
将噬菌体A149与宿主菌按照10:1、1:1、0.1:1、0.01:1和0.001:1的比例分别混合后37℃振荡培养6 h，双层平板法计算各个比例下噬菌体的效价。结果如表1所示，当MOI=0.001时，噬菌体A149生长扩增最佳，可达1.0×1010 PFU/mL，所以0.001为噬菌体A149的最佳感染复数。
表1噬菌体A149的最佳感染复数测定
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