1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原辅料与菌种：河北省石家庄优质鸭梨、秦美猕猴桃、红富士苹果、白砂糖，购自四川宜宾超市；Lalvin71B酵母，法国LALLEMAND公司。
1.1.2 培养基：YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%（其中固体培养基需要额外添加2%的琼脂）；121 ℃，0.15 MPa，灭菌20 min。
1.1.3 主要试剂：蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉（均为生化试剂），成都市科隆化学品有限公司；偏重亚硫酸钾、浓盐酸、氢氧化钠、无水葡萄糖、无水乙醇、酒石酸钾钠（均为分析纯），北京奥博生物技术有限公司；2 Í Taq Master Mix（生化试剂），大连宝生物；Lallzyme EX果胶酶（生化试剂），法国拉曼公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（生化试剂），北京智杰方远科技有限公司。
1.2 仪器与设备
MicroScreen-HT实时微生物生长曲线分析仪，杰灵仪器制造（天津）有限公司；SW-CJ-1F超净工作台，上海博讯实业有限公司；DM3000生物显微镜，德国徕卡；MaxQ4000恒温冷冻摇床，美国Themo科技公司；ProtoCOL3菌落计数分析仪，北京生科宇晟科技有限公司；M367983 PCR仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；CI54DS立式压力蒸汽灭锅，厦门仪器有限公司；WYT-Ⅱ A手持糖度仪，成都格纳丝商贸公司；HR1833榨汁机，中国飞利浦公司。
1.3 方法
1.3.1 产香酵母的分离纯化：选取新鲜鸭梨、猕猴桃、苹果的果皮和枝梗以及中高温大曲各10 g，用无菌水重悬1 h后吸取1 mL接种于加有青霉素的YPD液体培养基，28 ℃、180 r/min条件下富集培养48 h。取上述培养液1 mL稀释至10-3、10-4、10-5，分别取100 mL均匀涂布于YPD固体培养基上，28 ℃恒温培养48 h。当平板上长出菌落时，将一滴美蓝染色剂与微量菌落混合在载玻片上，并用盖玻片覆盖，然后在显微镜下观察细胞形态。挑取具有典型酵母特征的单菌落连续划线传代培养2–3次后得到纯化菌株，与60%无菌甘油1:1混合，于-80 ℃冷藏保存。
1.3.2 产香酵母的初筛：将冻存的菌株活化后在YPD固体培养基上划线接种，在28 ℃条件下培养48 h。参考刘文丽等人的嗅闻法，将斜面置于鼻孔下方嗅闻，评价指标为香气的有无、浓淡等产香效果，初步筛选出香气较浓或香气特殊的菌株。
1.3.3 产香酵母的复筛：将初筛出的菌株活化，以3%接种量接种于含100 mL产酯发酵液（8%葡萄糖、1%酵母浸粉、2%蛋白胨）的锥形瓶中，28 ℃条件下静置发酵7 d，取150 mL培养液转入250 mL圆底烧瓶中，采用回流皂化法测定培养液的总酯含量（以乙酸乙酯计），筛选出产酯量较高的菌株。
1.3.4 产香酵母的分子生物学鉴定：产香酵母的DNA提取，参考赵宏宇等人的方法。产香酵母的菌株序列扩增：以序列NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）为正向引物和NS4（5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′）为反向引物，扩增酵母菌18S rRNA序列。PCR反应体系，参考李瑞平等人的方法：Master Mix 25 mL，正、反向引物（10 mmol/L）各1 mL，ddH2O补充至21 mL，DNA模板2 mL。PCR反应条件，参考农颖杰等人的方法：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s；54 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR程序执行结束后取出产物，于4 ℃保存。PCR产物电泳检测：上样，吸取3–5 mL PCR扩增产物点样，以分子量大小为2 000的DNA Marker（2 mL）为标准，电泳电压为120 V。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照试剂盒操作步骤回收条带，产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，在NCBI网站用BLAST将测序结果进行比对，挑选合适的序列，比对并生成系统发育树。
1.3.5 产香酵母的生长曲线及耐受性分析：产香酵母的生长曲线测定：参考刘小雨等人的方法，取30 mL活化后的产香酵母菌液，加入含有970 mL YPD液体培养基的48孔板中，每个样品设置3个平行实验，每块孔板设置3个空白试验以检验该孔板是否染菌。将孔板放置于实时微生物生长曲线分析仪中，冷水槽温度设置为0 ℃，样品槽内腔温度设置为28 ℃。以30 min的时间间隔测量OD600值，持续48 h。记录数据，以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制不同产香酵母的生长曲线图。
产香酵母耐受性分析：参考刘晓柱等人的方法，以YPD液体培养基为基础培养基，通过单因素试验，考察不同二氧化硫含量（100、200、300、400、500 mg/L）、不同酒精度（7% vol，9% vol，1% vol，13% vol，15% vol）、不同初始糖度（100、150、200、250、300 g/L）、不同培养温度（22、25、28、31、34 ℃）条件下产香酵母的OD600值，筛选出耐受能力较强的酵母菌株。
1.3.6 产香酵母与酿酒酵母混菌发酵果酒的制备工艺：参考张琛等的果酒酿造工艺流程：水果分选→清洗→去皮→打浆→抑菌（添加偏重亚硫酸钾）→酶解（加入0.02 g/L的果胶酶室温酶解2 h）→调糖（22° BX）→接种产香酵母（3%产香酵母种子液）→发酵（28 ℃静置发酵24 h）→接种酿酒酵母（3%酿酒酵母种子液）→发酵（28 ℃静置发酵7 d）→固液分离→澄清→过滤→成品。
产香酵母活化：将冻存酵母菌种用YPD液体培养基，于30 ℃、180 r/min条件下培养24 h，按3%接种量接种与新的YPD液体培养基，于30 ℃、180 r/min条件下静置培养24 h，离心，用无菌生理盐水调整菌体数达到1 × 108 CFU/mL，备用。
酿酒酵母干粉活化：取适量干酵母，加入10倍体积的糖溶液，于28 ℃条件下静置培养30 min，再接种至10倍体积的果汁中，于28 ℃条件下静置培养极培养24 h，用无菌生理盐水调整菌体数达到1 × 108 CFU/mL，备用。
1.3.7 产香酵母混菌发酵果酒的感官评价：在专业品评室内由12名品评小组成员（男女各6名，年龄20–40岁）采用定量描述感官分析法，对混菌发酵和单菌发酵的梨酒、猕猴桃酒、苹果酒进行观察、嗅闻、品尝，在外观、香气、口感方面进行感官品评，产香酵母混菌发酵果酒的感官评分标准参考文献进行，具体见表1。
1.3.8 产香酵母混菌发酵果酒的理化指标检测：酒精度、总糖含量、总酸含量的检测参照GB/T 15038-2006和《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
表1 产香酵母混菌发酵果酒感官评分标准
1.4 数据处理
结果采用平均值±标准差（mean ± SD）表示，每个试验平行3次。应用WPS软件进行数据整理和统计，应用IBM SPSS Statistics 27软件进行方差分析（ANOVA），应用Origin 2021和Excel软件绘图。