一、实验目的
本实验以携带真菌病毒的病原真菌菌株及无病毒等基因对照菌株为研究对象，依托Bioscreen C微生物生长分析仪结合低浓度半固体琼脂体系，规避传统固体平板观测局限与液体培养菌丝沉降、贴壁、团聚等问题。通过实时动态监测菌株培养过程中的OD值变化，连续采集48–72 h真菌生长时序数据，拟合获取延滞期、最大比生长速率、曲线下面积、最大生物量等核心生长动力学参数。定量分析真菌病毒侵染对寄主真菌孢子萌发、菌丝增殖及整体生长态势的影响，计算菌丝生长抑制率，明确真菌病毒对寄主真菌生长的调控效应。
二、实验材料与准备
1.仪器与耗材
芬兰Bioscreen C微生物生长分析仪，原厂100孔蜂窝微孔板，无菌移液器，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，血球计数板，无菌纱布，滤膜。寄主真菌菌株，携带真菌病毒的同株系菌株（病毒侵染株），无病毒的等基因对照菌株。基础培养基选用PDB或者YES培养基，琼脂粉，0.05%吐温80，无菌生理盐水。
2.培养基配制（低琼脂半固体培养基，Bioscreen丝状真菌专用）
称量基础培养基成分，按照配方溶解，加入琼脂至终质量体积分数0.125%，充分混匀后高压灭菌121℃，20 min。灭菌完成后置于42‑45℃水浴保温，防止琼脂提前凝固，全程维持液态状态，温度不可低于40℃，避免琼脂局部结块。如果需要，可添加终浓度0.05%吐温80，降低孢子疏水团聚。设置两组培养基体系，一组用于带真菌病毒菌株，一组用于无病毒对照菌株。
3.孢子悬浮液制备
将带真菌病毒的寄主真菌、无毒对照菌株分别接种PDA平板，适宜温度（一般25‑28℃）培养7 d，充分产孢。使用无菌生理盐水冲洗平板表面孢子，收集孢子悬液，四层无菌纱布过滤，去除菌丝碎片，再经无菌滤膜过滤，只保留单孢子。用血球计数板计数，调节孢子悬液终浓度至1×10^5孢子/mL。整个过程避免菌丝团带入，否则会造成孔间OD重复性变差。
4.对照组设置
病毒处理组：半固体培养基+携带真菌病毒的真菌孢子；
空白对照组：半固体培养基+无毒对照菌株孢子；
无菌空白孔：只加入半固体培养基，用于基线扣除；
每组设置至少5个技术重复，同时设置3次生物学重复。
三、微孔板加样与接种操作
1.待灭菌半固体培养基水浴稳定在42‑45℃，无菌条件下向蜂窝板各孔加入半固体培养基，单孔终体积250‑300 μL。加样过程间断轻轻摇晃培养基容器，防止琼脂沉降。
2.迅速加入制备好的标准化孢子悬液，轻柔吹打3‑4次混匀，不要产生气泡。气泡会干扰仪器光路，造成OD异常跳变。
3.全部孔加样结束，微孔板室温静置15‑20 min，使低浓度琼脂形成弱凝胶，将孢子束缚在介质内部，防止后续菌丝沉降、贴壁攀爬。凝胶不会阻碍菌丝延伸生长。
4.盖上Bioscreen配套盖板，选择透气盖板保证气体交换，同时减少长时间培养水分蒸发。检查每孔无气泡、无溢出，孔外无液体残留。
四、Bioscreen仪器上机与参数设置
1.将蜂窝板平稳卡入仪器卡槽，确认卡槽卡紧，关闭舱门。开启仪器、配套电脑，关闭电脑休眠、USB省电模式，避免长时间监测中断数据记录。
2.软件新建实验，录入微孔板布局，标记病毒实验组、无毒对照组、空白孔位置，保存布局。
3.培养参数设置：孵育温度按照真菌适宜生长温度，多数植物病原真菌设置28℃；开启间歇低速振荡，振荡模式选择medium，不要连续高频振荡，防止破坏半固体凝胶网络；检测波长设置600 nm；读数间隔20 min；总监测时长48‑72 h；热盖温度高于培养温度1‑2℃，防止冷凝水滴落。
4.基线校正选择无菌空白孔作为校正基准，数据输出格式设置为CSV时序文件。执行预扫描，确认初始基线平稳，没有异常波动后，启动正式监测。
5.实验运行期间禁止打开舱门，禁止修改参数，保证全程密闭自动采集OD浊度数据。OD数值与半固体体系内菌丝总生物量具备线性对应关系。
五、数据导出与定量分析
1.实验结束导出全部时序OD数据，扣除无菌空白基线，得到校正后OD生长曲线。软件可以调用Gompertz或者Baranyi模型拟合，输出延滞期λ，最大比生长速率μmax，曲线下面积AUC，最大ODmax等动力学参数。
2.生长抑制定量计算，以无毒对照菌株作为参照。
菌丝生长抑制率（基于AUC）=（对照组AUC‑病毒侵染组AUC）÷对照组AUC ×100%。也可以对比最大比生长速率μmax、到达特定OD的时间，评价真菌病毒对菌丝生长的抑制程度。
3.剔除异常孔数据：出现孔内气泡、局部菌丝团块造成曲线异常跳动的数据予以剔除。统计每组重复的均值、标准差，计算RSD，合格实验RSD应小于15%。
4.补充验证：可以选取时间点，将孔内半固体培养基取出，过滤收集菌丝，烘干测干重，建立OD‑菌丝干重标准曲线，进一步确认比浊定量的可靠性。
六、关键细节与常见问题规避
培养基琼脂浓度严格控制在0.125%，琼脂过高凝胶过硬，菌丝无法伸展生长；琼脂过低起不到束缚沉降效果，OD失真。培养基温度要严格控制，温度太高会损伤孢子，温度过低琼脂凝固，无法混匀接种。
接种物必须是过滤纯化的单孢子悬液，不能直接接种菌丝片段，菌丝片段会造成局部大量生长，孔与孔之间重复性差。
半固体凝胶成型后，不要再剧烈振荡，凝胶被破坏就会发生菌丝沉降。
部分真菌病毒可能造成寄主萌发延迟，需要保证足够总监测时长，不能过早停止实验，避免错过生长拐点。
需要排除培养基、吐温80等试剂本身对真菌生长的影响，必要时设置试剂对照。