一、实验目的
1. Bioscreen仪器仅能够测定浊度OD数值，无法直接观察、记录粘细菌的滑动运动、集群铺展行为，本方案提供可落地的替代实验体系，定性及半定量评价粘细菌滑动生长能力。
2. 实现粘细菌集群滑动速率、菌落铺展形态、运动能力的观测与数据采集，弥补Bioscreen不能成像、无法记录表面运动行为的缺陷。
3. 可将替代实验结果与Bioscreen测得的生长浊度数据联合分析，区分菌株生长增殖和表面滑动运动两种表型。
二、实验材料与仪器
1. 实验菌株：目标粘细菌菌株，保存于合适的保藏管。
2. 培养基：粘细菌适宜的固体滑动培养基（低琼脂浓度，琼脂0.3%‑0.5%，用于观察滑动；正常琼脂1.5%用于菌种活化），液体培养基用于制备菌悬液，全部121℃高压蒸汽灭菌20min。低浓度琼脂是粘细菌滑动关键，琼脂浓度过高会抑制滑动，过低则培养基无法成型。
3. 试剂：无菌生理盐水或者无菌液体培养基，75%乙醇。
4. 仪器：超净工作台，恒温培养箱，体视显微镜，光学显微镜，刻度尺，数码相机或者平板菌落成像系统，高速离心机，芬兰Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪（用于同步测定生长OD，区分生长和运动）。
5. 耗材：无菌培养皿，移液枪及无菌枪头，无菌离心管，打孔器，玻璃涂布棒。
三、预实验准备
1. 菌株活化。将保存的粘细菌菌株接种至1.5%琼脂的活化平板，置于适宜温度恒温培养，获得新鲜单菌落，避免使用老化保藏菌株，老化菌株滑动能力会下降。
2. 菌悬液制备。挑取新鲜粘细菌菌落，转移至无菌离心管，加入无菌液体培养基或者生理盐水，轻轻吹打重悬菌体，低速离心洗涤菌体2次，去除代谢物。调节菌悬液浓度，使用Bioscreen测定OD600，统一所有菌株初始接种OD，保证接种量一致，排除生长快慢对滑动表型的干扰。
3. 滑动平板制备。灭菌后的低琼脂滑动培养基冷却至45‑50℃，在超净工作台内倒平板，每皿倒入20mL培养基。倒好的平板开盖倒置放置30‑60min，充分晾干平板表面冷凝水，表面有水会造成菌体漂流，不是真实滑动运动。平板现配现用或者密封保存，使用前再次晾干表面水汽。
4. Bioscreen对照准备。配制相同成分液体培养基，准备Bioscreen微孔板，设置对应菌株的生长测定孔，用于后续获得菌株生长曲线，区分“长得快”和“滑动快”两种现象。
四、正式实验操作步骤
1. 接种处理。设置两种接种方式，分别对应点接种和滴接种，根据实验需求选择。
点接种：使用无菌打孔器，从活化平板上打出直径5mm的完整菌落琼脂块，菌落面朝下，轻轻放置在晾干的低琼脂滑动平板中央。每个菌株设置至少5个生物学平行平板，同时设置阴性对照菌株。
滴接种：吸取5μL标准化OD的菌悬液，小心滴加在滑动平板中央，滴液自然吸收晾干，不要晃动平板。每个菌株设置至少5个生物学平行平板。
2. 恒温培养。将全部接种完成的滑动平板倒置放入恒温培养箱，设置菌株最适培养温度。培养过程不要移动、晃动培养皿，防止液体流动造成菌体移位。设置系列观察时间点，例如24h、48h、72h、96h，粘细菌滑动属于慢生长表型，需要根据菌株特性延长观察时间。
3. 宏观菌落铺展观测。到达设定观察时间点，取出平板，使用菌落成像系统或者数码相机对平板进行拍照记录，拍照保持光源、距离、角度完全统一。使用刻度尺测量菌落直径，计算菌落向外铺展的半径，滑动速率=不同时间点菌落铺展净距离/培养时间，单位mm/d。记录菌落形态，包括边缘是否整齐，是否形成子实体，集群铺展模式。
4. 微观滑动行为观察。将平板放置在体视显微镜下，观察菌落边缘细胞集群形态。也可以采用载玻片盖玻片的微型滑动装置，取融化后的低琼脂培养基滴于载玻片，铺成薄层，冷却后点接菌液，盖上盖玻片，置于湿盒内培养。定时使用光学显微镜观察边缘单细菌或者小集群移动，拍摄照片或者短时间录像，记录微观运动特征。该方法适合定性观察细胞运动行为，不容易测宏观速率。
5. Bioscreen平行生长测定。同步开展Bioscreen液体培养实验，微孔板加入液体培养基，接入相同初始浓度的粘细菌，设置仪器参数，合适温度，间歇震荡，测定OD600生长曲线。获得菌株液体条件下的增殖速度。用来排除“菌株本身增殖快，造成菌落变大”的干扰，如果液体生长速率接近，固体平板菌落直径差异则来源于滑动运动能力差异。
6. 排除假阳性对照设置。设置热灭活菌体对照组，接种同等浓度高温杀死的粘细菌。灭活组菌落不会向外铺展，以此区分真正的主动滑动和液体漂流、扩散造成的菌落扩大。
7. 数据持续采集。持续培养、测量、拍照直至滑动菌落铺满平板，结束实验。
五、数据处理与结果分析
1. 整理平板测量数据，计算每个平行平板不同时间点菌落半径，计算平均滑动速率以及标准差。
2. 整理Bioscreen输出的液体生长OD数据，绘制生长曲线，得到代时和生长速率。
3. 对比分析，同一菌株比较固体滑动速率与液体生长速率。不同菌株之间，在校正生长速度差异后，比较滑动能力。
4. 定性记录菌落表型，包含菌落边缘形态、子实体形成、集群形态，作为滑动表型重要辅助依据。
5. 统计分析，使用统计学方法比较组间滑动速率差异，判断处理条件对粘细菌滑动的影响。
六、关键注意事项
1. 平板表面冷凝水必须充分去除，残留水分会让菌体随液体漂移，造成假滑动现象，导致实验结果完全错误。
2. 琼脂浓度需要预实验优化，粘细菌滑动对琼脂浓度非常敏感，琼脂浓度轻微变化，滑动速率会发生显著改变。所有实验组平板琼脂含量、倒板体积、晾干时间必须完全统一。
3. 接种量必须标准化，菌浓度高低会直接影响菌落铺展速度，需要借助Bioscreen统一初始接种OD。
4. 粘细菌生长缓慢，培养时间较长，平板培养需要防止干燥失水，可以将平板装入密封袋或者置于湿盒内培养，避免培养基干裂影响滑动。
5. Bioscreen只能反映液体环境下的增殖，固体表面滑动运动和液体生长是独立表型，不能用Bioscreen的OD结果直接代表滑动能力，二者需要互相参照。
6. 尽量避免平板震动搬运，移动会改变菌体位置，引入实验误差。