一、实验目的
1. 建立霉菌菌液OD浊度与菌丝生物量的线性对应关系，确定线性有效区间。
2. 得到该实验条件下OD值与菌丝干重的换算公式，后续可通过OD快速估算霉菌生物量，替代繁琐的干重称量操作。
3. 验证在实验所用菌株、培养基、培养条件下，浊度法用于霉菌生长定量的可行性。
二、实验材料与仪器
1. 实验菌株：目标实验霉菌菌株，保存于斜面培养基。
2. 培养基：液体种子培养基、液体实验培养基，按照菌株要求配制，完成灭菌，121℃高压蒸汽灭菌20min。
3. 试剂：无菌生理盐水，75%乙醇。
4. 仪器：芬兰Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪，高速冷冻离心机，真空冷冻干燥机或者鼓风干燥箱，万分之一分析天平，高压灭菌锅，超净工作台，恒温培养摇床，无菌滤器，无菌离心管。
5. 耗材：无菌三角瓶，无菌移液管，无菌滤纸，滤膜，一次性比色杯。
三、预实验准备
1. 霉菌孢子悬液制备。在超净工作台内，向长满霉菌孢子的斜面管加入5mL无菌生理盐水，使用无菌接种环轻轻刮取斜面表面孢子，尽量不刮下琼脂菌丝块。将悬液转移至无菌试管，涡旋充分震荡打散孢子团，使用多层无菌纱布过滤除去菌丝碎片，获得均一孢子悬液。用血球计数板计数，调整孢子悬液初始孢子浓度。
2. Bioscreen仪器参数预设置。选择测定波长，霉菌常用波长600nm；设置震荡模式，霉菌菌丝容易沉降，需要设置间歇震荡，每30min震荡60s；设置培养温度，根据菌株最适生长温度设定；设置读数间隔时间15‑30min；设置总培养时长，覆盖低、中、高生物量区间。空白孔设置为未接种的无菌液体培养基。
3. 确认本仪器空白背景，取无菌培养基装入Bioscreen板孔，测定OD600，记录空白本底值，后续所有OD结果需要扣除空白本底。
四、正式实验操作步骤
1. 接种处理。准备一系列相同的无菌三角瓶，分装等量的液体实验培养基。接入制备好的霉菌孢子悬液，设置多组梯度初始接种量，用来获得不同生物量水平的菌液，覆盖从低生长到中高生长范围。同时设置不接种的空白对照组三角瓶。
2. 恒温摇床培养。将全部三角瓶放置恒温摇床，与Bioscreen仪器培养温度保持一致，转速设置合适，进行振荡培养。按照预设时间梯度取样，取样点至少设置8个梯度，包含生长延迟期、对数生长期、生长接近平台期，避开大量菌丝结球的过生长阶段。每个取样点设置3个生物学平行。
3. Bioscreen OD浊度测定。到达取样时间点，在超净台吸取充分混匀的霉菌菌液。菌液需要充分吹打打散菌丝小团块，保证菌液均一。吸取200μL菌液加入Bioscreen多孔板的样品孔，每个样品设置3个技术平行；空白孔加入等量无菌培养基。将多孔板放入芬兰Bioscreen仪器，按照预设置程序进行测定，读取600nm下OD读数。测定完成后记录每一个样品原始OD值，扣除培养基空白本底，得到校正后OD浊度数值。
4. 菌丝生物量干重测定。取完成OD测定对应的同一份菌液，记录取样体积。使用已经烘干至恒重的滤纸或者滤膜进行真空抽滤，过滤收集全部菌丝体。使用无菌生理盐水洗涤菌丝3次，除去黏附的培养基残留成分。收集得到的菌丝，放置冷冻干燥机冻干，或者105℃烘箱烘干至恒重。冷却至室温后，万分之一天平称量，记录菌丝干重，换算为单位体积菌液生物量g/L。
5. 重复取样测定。按照时间梯度依次完成全部取样点的OD浊度读数以及菌丝干重称量，每个取样点生物学平行、技术平行全部记录数据。
6. 高浓度样品稀释处理。当样品OD超过仪器线性上限，菌液做梯度稀释，使用无菌培养基稀释，测定稀释后OD，结果乘以稀释倍数得到原始样品校正OD。注意霉菌菌丝稀释前务必充分打散，避免菌丝团聚造成误差。
五、数据处理与线性相关性分析
1. 整理全部配对数据，每一组数据包含校正后OD浊度值、对应单位体积菌丝干重。剔除菌丝大量结球、团聚严重的异常数据点。
2. 以校正OD浊度为x轴，菌丝干重g/L为y轴，进行线性回归拟合，计算回归方程y=ax+b，同时计算决定系数R²。
3. 判断线性效果，R²大于等于0.95，代表该区间内OD浊度和霉菌生物量线性相关性良好，可以使用OD估算生物量；如果R²偏低，需要缩小有效区间，确定该菌株适用的OD线性范围。
4. 标注实验条件，包括培养温度、波长、培养基、震荡条件，明确该换算公式只适用于本套实验条件，条件改变需要重新验证。
六、关键注意事项
1. 霉菌极易形成菌丝球，菌丝团聚会造成Bioscreen浊度读数严重偏离真实值，取样、转移、加样之前必须充分吹打、涡旋打散菌丝团。如果菌丝球过大，该样品数据作废。
2. Bioscreen多孔体系培养霉菌，长时间培养孔内会出现菌丝贴壁，会干扰OD读数，因此本验证实验优先采用摇瓶取样，再上机测OD，不要直接在Bioscreen板内长时间培养霉菌，减少贴壁菌丝干扰。
3. 空白本底必须扣除，不同批次培养基本底OD存在差异，每一批次实验都需要同步做空白。
4. 干重称量一定要烘干至恒重，两次称量差值小于0.0002g才算恒重，减少称量误差。
5. 超出线性区间后，OD不再随生物量升高成比例上升，不可以外推使用回归方程。
6. 孢子本身会贡献OD，实验需要区分孢子和菌丝，若孢子大量产生，会干扰浊度‑生物量对应关系。