一、实验材料与试剂准备
1. 仪器设备
芬兰Bioscreen C微生物生长曲线分析仪，配套100孔蜂窝板，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，恒温水浴锅，电子天平，pH计，磁力搅拌器，高速离心机，涡旋振荡器。
Bioscreen仪器注意事项，蜂窝板只能使用仪器适配的专用板，禁止普通96孔板；测定波长设置范围420‑600nm，真菌菌丝比浊常用600nm；仪器孵育温度可调，可设置振荡或静止培养模式。
2. 试剂配制
半固体琼脂培养基，根据目标根际真菌营养需求选择基础培养基，例如PDB（马铃薯葡萄糖肉汤）作为液体基础，琼脂用量0.2‑0.4%配置半固体，该琼脂浓度可以维持半固体状态，允许真菌菌丝延伸生长，又不会完全液化流动。
配制步骤，称量培养基干粉，加入去离子水，搅拌溶解后调节pH至5.5‑6.0，根际真菌适宜pH范围，再加入琼脂粉，搅拌均匀，121℃高压灭菌20min。灭菌完成后置于50‑55℃水浴锅中保温，防止琼脂提前凝固。
无菌对照液，无菌去离子水，75%乙醇，0.1M HCl、0.1M NaOH用于pH微调。
菌丝接种母液制备试剂，无菌生理盐水或者无菌PDB液体培养基。
二、标准曲线制备
1. 根际真菌预培养
将目标根际真菌在固体PDA平板25‑28℃恒温培养，待菌丝充分生长，用无菌打孔器取相同大小菌丝块，转入液体PDB，28℃静置或者低速摇床预培养7‑14天，获得成熟菌丝。
2. 菌丝悬浮梯度制备
无菌条件下收集菌丝，用无菌生理盐水洗涤菌丝2‑3次，去除残留培养基成分，滤纸吸干表面水分，称量菌丝鲜重。将菌丝转移至无菌离心管，加入无菌半固体培养基，涡旋充分打散，尽量打碎菌丝团，制备高浓度菌丝母液。
用50‑55℃保温无菌半固体培养基对母液进行梯度稀释，设置6‑8个菌丝鲜重浓度梯度，覆盖实验样品预估浓度区间，同时设置空白，只加半固体琼脂培养基，不含菌丝。整个操作保持温度50‑55℃，避免琼脂提前凝固造成菌丝分布不均。
3. Bioscreen加样与标准曲线测定
在超净台内，向Bioscreen专用100孔蜂窝板各孔加入300μL不同浓度菌丝‑半固体琼脂体系，每个浓度设置3‑5个生物学重复，空白孔只加等量无菌半固体培养基。加样过程避免产生气泡，气泡会干扰浊度读数。加样完毕后，室温放置数分钟待半固体琼脂完全凝固。
将蜂窝板放入Bioscreen仪器，设置参数，测定波长600nm，孵育温度28℃，静止培养模式，每2‑4小时读取浊度OD600数值，连续读取4‑7天。记录每个梯度的平均OD值，扣除空白半固体琼脂本底OD。以菌丝鲜重为X轴，扣除空白后的OD600均值为Y轴，拟合线性标准曲线，得到回归方程，只在线性区间内用于样品换算。
注意，半固体体系中菌丝容易沉降聚集，若线性相关系数R²低于0.95，需要重新优化菌丝打散方式以及琼脂浓度。
三、根际真菌菌丝样品测定完整操作流程
1. 样品预处理
收集根际真菌菌丝样品，若是根土体系分离得到的菌丝，无菌生理盐水冲洗，去除土壤颗粒杂质。尽量去除植物根系残片、土壤碎屑，杂质会造成浊度假性偏高。将处理后的菌丝置于无菌离心管，加入少量无菌预热半固体培养基，涡旋振荡充分打散菌丝团，肉眼观察尽量无肉眼可见大菌丝团块。
2. Bioscreen板加样
将预热保温50‑55℃的半固体培养基与菌丝样品按照实验设计比例混合，充分混匀。每孔加入300μL样品‑半固体琼脂混合液，每个样品设置3‑5技术重复，同时设置空白对照孔，仅添加相同批次半固体琼脂培养基。加样时避免产生气泡，若孔内出现气泡，可短暂离心蜂窝板去除气泡。
加样完成，超净台内静置，等待孔内半固体琼脂完全凝固，凝固之后再上机，防止液体晃动造成菌丝沉降分层。
3. Bioscreen仪器运行设置
打开Bioscreen软件，新建实验方案。
选择测定波长600nm；孵育温度设置28℃；选择静止模式，半固体琼脂不能剧烈振荡，振荡会破坏半固体凝胶结构；测定时间间隔设置2‑4h，总运行时间根据根际真菌生长速率设置3‑7天；勾选记录每个孔OD数值。
放置蜂窝板，确认仪器盖板闭合，启动运行。
4. 数据读取与换算
实验结束导出全部OD数据，每一个时间点的样品OD减去同批次空白半固体琼脂本底OD，得到校正OD值。
将校正OD带入前期建立的标准曲线回归方程，计算对应孔内菌丝鲜重。统计重复的均值、标准差。
半固体琼脂比浊，得到的是菌丝相对生物量，半固体中菌丝会继续生长，若要测定初始接种菌丝量，需要选取0h时刻校正OD代入曲线；若要观测菌丝生长动态，则使用不同时间点OD表征菌丝生长情况。
四、关键细节与问题处理
1. 琼脂浓度选择
琼脂0.2%，凝胶很软，菌丝可以自由伸展，但是容易发生菌丝沉降；琼脂0.4%，凝胶强度更高，抑制菌丝沉降，但会限制菌丝延伸。正式实验前需要做预实验确定最优琼脂浓度。琼脂浓度过高会造成本底浊度上升，空白OD增大。
2. 气泡与菌丝团干扰
加样气泡会造成OD异常偏高。菌丝团块会造成同一孔读数波动大，重复之间偏差大，样品一定要充分涡旋打散；不能打散的菌丝不适合该比浊定量方法。
3. Bioscreen仪器适配限制
Bioscreen比浊是光透过凝胶体系读数，半固体琼脂不能过厚，严格控制每孔体积；不能使用普通96孔板，必须使用仪器配套蜂窝板。不要设置高速振荡，高速振荡会破坏半固体凝胶结构，体系液化，实验失效。
4. 污染控制
全程无菌操作，细菌污染会增加浊度，导致结果虚高；培养基灭菌彻底，操作全部在超净工作台内完成。
5. 方法局限性
该方法适合相对定量，适合高通量比较多组根际真菌菌丝生物量差异；不能直接区分死菌丝与活菌丝；土壤微小残渣杂质会干扰OD读数，样品预处理必须去除杂质。
五、实验可复现注意事项
全部培养基pH、琼脂浓度、孵育温度、测定波长、加样体积需要全程保持统一。每一批次半固体琼脂培养基，都需要同步做空白对照，最好同步运行标准曲线，消除不同批次培养基本底差异。每个样品必须设置多重复，用于判断数据可靠性。如果R²低于0.95，重新制备菌丝悬浮液，重新做标准曲线。