一 实验目的
依托芬兰Bioscreen高通量微孔培养‑浊度检测平台，采用正交试验设计调配多种抗菌组分的浓度配比，高通量测定受试致病菌在不同制剂配方下的生长动力学特征。通过延滞期、最大生长速率、稳态生物量、菌体复苏周期等指标筛选抑菌效果最优的复合抗菌制剂组合，分析每种原料的影响权重，建立一套可复现的正交配比高通量筛选操作流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 受试菌种、培养基以及抗菌原料母液
将靶标致病菌在固体平板划线纯化，多次转接获得纯净单菌落，后续开展液体活化。配置适合该细菌增殖的液体基础培养基，高压灭菌之后冷却备用。
准备正交试验当中需要用到的各类抗菌活性物质，例如植物提取物、抑菌多肽、金属离子、有机酸、表面活性剂等；遇高温失活的组分使用无菌滤膜过滤除菌，避光保存。
提前完成正交试验表设计，设置各个抗菌因子对应的浓度梯度；实验分组包含空白培养基对照组、无药剂的细菌空白生长对照组、正交试验全部配方实验组。
2. 耗材以及仪器调试
准备原厂深井蜂窝微孔培养板、透气密封硬盖板，全部耗材高压灭菌、烘干冷却之后备用。
擦拭仪器上下两侧光学检测窗口，清除残留菌体、培养基污渍；检查孵育舱门密封胶条完好，腔体导热液处在规定液位。设备空载通电预热30 min，稳定光源输出、舱内温度场，规避长时间监测过程出现基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 标准化细菌菌悬液制备
挑取纯化后的单菌落接入新鲜液体培养基，恒温摇床培养至对数生长期。无菌条件下离心收集菌体，无菌磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次，除去旧培养基代谢产物。
利用分光光度计校准菌液OD值，统一全部实验组别的初始菌体接种浓度，消除初始菌量差异干扰筛选结果。
2. 正交实验组微孔板加样操作
全程在超净工作台内进行加样，单孔反应体系总体积固定为220 μL。按照正交表格当中的浓度配比依次添加基础培养液、不同浓度的各类抗菌组分，最后接入已经调好浓度的细菌菌悬液。
每一组正交配方设置6个生物学平行孔，空白对照孔、阴性对照组分散排布在微孔板当中。蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水作为蒸发缓冲孔，削弱长时间孵育水分蒸发造成抗菌试剂浓缩。
加样结束之后扣合原厂透气硬盖板，按压卡扣完全锁紧，保证微孔通气顺畅，阻隔外界环境杂菌污染。
3. Bioscreen仪器运行参数设定
设置致病菌适宜的孵育温度，开启双层加热热盖，热盖温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8 ℃，避免水汽冷凝附着光路镜片。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后采集读数；振荡档位柔和，只用来悬浮菌体，不会造成细菌细胞破损。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，抗菌试剂颜色、细菌代谢色素不会干扰菌体散射光检测；数据采集间隔设置20 min，整体监测时长不少于72 h，完整记录细菌延滞萌发、对数增殖、平台稳定以及后期抗性菌复苏全过程。
4. 密闭高通量动力学监测与验证筛选
关闭仪器孵育舱门，整个监测阶段不得开启舱门。仪器自动采集全部微孔的浊度数据，生成每一组正交配方对应的细菌生长动力学曲线。
初次正交筛选结束之后，根据抑菌效果极差分析各个抗菌组分的主次影响因素；接着围绕最优配比附近设置精细浓度梯度开展复筛，确定复合抗菌制剂最佳工作浓度。
四 生长动力学指标与正交试验数据分析方法
1. 生长延滞期
对比阴性对照组与各个制剂实验组细菌开始增殖的时间，延滞期越长代表制剂抑制细菌复苏能力越强。
2. 对数期最大生长速率
细菌增殖速率越低，配方抑菌性能越好；通过极差分析判断每一种抗菌原料浓度对于生长速率的影响大小。
3. 平台期饱和浊度
稳定阶段菌体浊度越低，能够存活的最大细菌生物量越少，代表杀菌抑制效果越优秀。
4. 抗性菌体复苏时长
长时间观察生长曲线，记录被压制之后抗性细菌重新增殖回升的时间，用来评价复合制剂长效抗菌能力。
5. 正交极差与方差分析
整理所有组别动力学参数，计算各个因子不同浓度水平的均值以及极差，区分主效因子、次要因子，确定最优组合配比。
五 实验收尾和仪器养护
1. 筛选工作结束之后导出全部微孔原始动力学数据，整理延滞期、生长速率、饱和浊度、复苏时间等参数，完成正交极差计算、表格整理和生长曲线绘制。
2. 微孔板内部含有致病菌的培养液经过高压灭菌之后再处理废液；透气硬盖板清洗除菌、高压灭菌之后收纳存放。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理水汽、培养基飞溅残渣，腔体自然风干之后关闭设备，定期检查舱门密封胶条损耗情况。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 所有实验组初始菌液浓度、培养基pH、孵育温度、振荡参数保持一致，只改变正交设计当中抗菌组分的浓度。
2. 容易氧化、光降解、高温失活的抗菌物质现配现用，配置过程避光操作，采用滤膜除菌。
3. 平行样本、对照组分散排布在微孔板各个位置，抵消边缘孔水分蒸发过快产生的板边效应。
4. 孵育全程舱门紧闭，温度、氧气波动会改变细菌生理状态，造成正交筛选的数据出现偏差。
5. 监测周期充足，防止观测时长不足，无法察觉到后期抗性细菌复苏，误判复合制剂的抑菌性能。