一 实验目的
借助Bioscreen高通量微孔长时间浊度监测系统，测定单一防霉剂以及多种防霉剂复配组合对受试霉菌或者腐败真菌的抑制效果，通过对比各组真菌生长延滞期、菌丝增殖速率、稳态生物量、生长复苏时间等动力学指标，筛选具备协同抑菌效果的防霉剂配比，建立标准化、可重复的防霉剂复配协同作用高通量动力学评价实验流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 受试菌株、培养基以及防霉剂母液
将靶标污染真菌在固体培养基划线纯化，多次转接获取纯净菌种，制备孢子悬浮液备用。配制适合受试真菌生长的液体马铃薯基础培养液，完成高压灭菌处理。
分别配置各类防霉剂储备母液，高温容易分解的药剂采用无菌滤膜过滤除菌。
实验分组设置空白培养基对照组、无防霉剂的真菌正常生长对照组、每种防霉剂单独处理组、不同浓度比例的防霉剂复配实验组。
2. 耗材以及仪器调试
准备原厂深井蜂窝微孔板、透气硬盖板，全部耗材高压灭菌之后晾干备用。
擦拭仪器上下光学检测窗口，清除之前实验残留的菌体残渣与培养基污渍，检查舱门密封胶条完好无损，腔体导热液维持在标准液位。设备空载通电预热30 min，稳定氙灯光源输出以及腔体内部温度场，规避长时间检测期间光路基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 真菌孢子悬浮液配制
挑取纯化后的真菌平板，收集成熟孢子，使用无菌缓冲液冲洗制成孢子悬液，经过纱布过滤除去菌丝残渣。采用分光光度计调整孢子悬浮液浓度，保证所有实验组别的初始接种孢子数量保持一致。
2. 微孔板高通量加样操作
在超净工作台内部开展加样操作，单孔培养液总体体积固定为220 μL。依次添加无菌基础培养液、单一防霉剂或者复配防霉剂混合液，最后接入标准化真菌孢子悬液。
每一组药剂处理设置6个生物学平行孔，微孔板分区摆放空白对照组、空白真菌对照组、单药剂对照组、多组复配配比实验组。蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水作为蒸发缓冲孔，缓解长时间恒温孵育水分蒸发造成防霉剂浓度升高。
加样结束之后扣合原厂透气硬盖板，按压卡扣锁紧，保障微孔通气条件，阻隔外界杂菌、杂孢造成污染。
3. Bioscreen仪器运行参数设定
设置受试真菌适宜的孵育恒温温度，开启双层加热热盖，上层盖板温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8 ℃，防止水汽冷凝附着光路盖板，干扰浊度采集。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后再采集读数，振荡强度轻柔，只用来混匀培养液，避免机械作用力打断新生真菌菌丝。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，防霉剂色素、真菌代谢有色物质不会干扰菌体散射光信号；数据采集间隔设置20 min，整体监测时长根据真菌生长周期设定为3‑7 d，完整记录孢子萌发、菌丝生长、后期抗性菌株复苏全过程。
4. 密闭式长期动力学监测
关闭仪器孵育舱门，全程密闭运行，整个监测周期当中禁止开启舱门。仪器不间断采集各个微孔浊度数值，自动生成所有防霉剂配比对应的真菌生长动力学曲线。
初筛得到具备抑制效果的复配组合之后，继续设置不同药剂浓度梯度开展复筛，确定协同效果最好的质量配比以及最低有效抑菌浓度。
四 生长动力学指标和协同抑菌效果判定方法
1. 孢子萌发延滞期
以接种孢子为计时起点，对比对照组和药剂处理组浊度开始上升的时间。复配防霉剂组别萌发延滞期明显长于所有单一防霉剂组别，则代表产生协同抑制萌发作用。
2. 菌丝最大生长速率
对数阶段菌丝增殖速度越低，药剂抑制能力越强；复配组生长速率低于单独药剂组，说明复配之后抑菌能力得到提升。
3. 平台期饱和浊度
平台浊度对应最终菌丝生物量，浊度越低代表防霉剂对于真菌增殖的压制效果越强。
4. 真菌复苏反弹时间
长时间观测生长曲线，记录被抑制的抗性真菌菌丝重新增殖、浊度回升的时间，优质复配配方可以大幅度延后甚至阻止真菌复苏。
5. 交互效应对比
参照单一药剂的抑制效果，计算复配组的抑菌指数，区分协同作用、相加作用以及拮抗作用。
五 实验收尾和仪器养护
1. 监测结束之后导出全部微孔原始浊度动力学数据，整理萌发延滞期、菌丝生长速率、饱和生物量、复苏时长等参数，绘制各组真菌生长曲线。
2. 微孔板内部含有真菌菌丝以及防霉剂的废液经过高压灭菌之后再做废液处置；透气硬盖板清洗干净、高压灭菌之后收纳存放。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理水汽、菌丝和培养基飞溅残留物，腔体自然风干之后关闭设备，定期检查舱门密封胶条老化、污渍堆积情况。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 所有组别真菌孢子初始浓度、培养温度、pH、振荡参数保持统一，只调整防霉剂种类以及配比。
2. 容易光解的防霉剂在配液和孵育阶段做好避光处理，防止药剂活性衰减。
3. 平行实验孔分散排布于微孔板各个区域，抵消边缘微孔水分蒸发过快带来的板边效应。
4. 真菌菌丝较为脆弱，振荡转速不宜过高，防止菌丝断裂影响浊度检测结果。
5. 需要充足的长期观测时长，短时间监测容易忽略后期抗性真菌复苏，错误判断防霉剂长效抑菌性能。