一 实验目的
依托Bioscreen高通量微孔培养以及生长动力学检测能力，针对营养缺陷型菌株，开展各类基础营养物质、复合营养组分的添加筛选，测定菌株在不同营养补充条件下延滞期、生长速率、最大生物量等生长参数；确认缺陷菌株必需的外源营养物质，对比单一营养以及组合营养的恢复培养效果，搭建可批量、可复现的缺陷菌株补充营养高通量筛选流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 实验菌株、基础培养基与营养补充底物
取出待测营养缺陷型菌株，在对应固体平板划线纯化，多次转接获取纯净单菌落。配制缺陷型菌株专用的基础贫瘠培养基，培养基内去除待筛查的各类营养组分，高压灭菌之后冷却备用。
提前配制各类营养物质母液，包含氨基酸、维生素、核苷、微量元素、糖类等筛选底物，热敏营养物质使用无菌滤膜除菌。
实验分组设置空白贫瘠培养基对照组、野生型正常菌株阳性对照组、各类单一营养添加实验组、多组分营养复配实验组。
2. 耗材以及仪器调试
准备原厂深井200孔蜂窝微孔板、透气硬盖板，所有耗材高压灭菌之后晾干待用。
擦拭仪器上下光学检测窗口，清除菌体残渣以及培养基残留污渍，检查舱门密封胶条完好，孵育腔体导热液处在标准液位。设备空载通电预热30分钟，稳定光源输出和腔体温度场，防止长时间监测过程当中光路基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 缺陷型菌株菌悬液制备
挑取纯化后的营养缺陷型单菌落，使用完全培养基活化培养至对数生长期。无菌条件下离心收集菌体，使用无菌缓冲溶液洗涤菌体三次，洗去菌体表面附着的外源营养残留，规避残留营养干扰筛选结果。
调整缺陷型菌株菌悬液OD数值，统一所有组别初始菌体接种浓度；同步制备野生型对照菌株菌液。
2. 微孔板高通量加样操作
在超净工作台内完成全部加样工作，单孔总体系体积固定为220 μL。先加入贫瘠基础培养基，之后分别添加不同种类或者组合的无菌营养补充母液，最后接入标准化菌悬液。
每组筛选条件设置6个生物学平行孔，微孔板分区排布空白孔、缺陷菌株无营养对照组、野生型对照组、单营养实验组、复合营养实验组。蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水作为蒸发缓冲孔，降低长时间孵育水分蒸发造成营养物质浓缩。
加样结束之后扣合透气硬盖板，按压卡扣锁紧，保证微孔通气顺畅，阻挡环境杂菌污染。
3. Bioscreen仪器运行参数设定
设置该菌株适宜的孵育恒温温度，开启双层加热热盖，热盖温度高于孵育温度0.5‑0.8℃，防止水汽冷凝遮挡光学窗口。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后采集浊度读数，轻柔振荡保证菌体悬浮均匀，不会损伤微生物细胞。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，部分营养底物带有的浅色素不会干扰菌体散射光检测；数据采集间隔设置20 min，整体监测时长设置72 h以上，覆盖菌株完整的生长周期。
4. 密闭高通量监测
关闭仪器孵育舱门，全程密闭运行，实验期间禁止开启舱门。仪器自动采集每一个微孔的浊度变化，生成所有营养处理条件对应的菌株生长动力学曲线。
初次大规模筛选结束之后，将能够恢复缺陷菌株生长的候选营养物质，再次设置浓度梯度开展复筛，确定最适添加浓度以及必需营养组合。
四 生长动力学指标以及筛选判定方法
1. 延滞期时长
贫瘠培养基对照组缺陷菌株延滞期很长甚至无法增殖；当外源添加必需营养，菌株延滞期明显缩短，代表该营养物质可以弥补菌株基因缺陷。
2. 对数阶段最大生长速率
生长速率越接近野生型对照组，说明该种营养补充物的修复效果越好；多种营养复配组别生长速率更高，则菌株存在多重营养缺陷。
3. 平台期饱和浊度
平台浊度代表菌株能够达到的最大菌体生物量，以此判断营养供给是否充足。
4. 营养浓度梯度验证
阳性候选营养设置梯度浓度，观察生长参数随浓度的变化趋势，确定最低有效添加浓度。
五 实验收尾和仪器养护
1. 筛选结束之后导出全部微孔原始动力学数据，整理各组延滞期、生长速率、平台浊度，对比筛选出可以恢复菌株生长的必需营养组分。
2. 微孔板内部含有活菌的培养液高压灭菌之后再进行废液处理，透气盖板清洗灭菌之后收纳存放。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理水汽和培养基飞溅残渣，腔体风干之后关闭设备，检查舱门密封胶条的完整状态。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 菌体洗涤步骤必须充分，洗去完全培养基附着残留营养，防止残留营养造成假阳性筛选结果。
2. 所有组别菌液初始接种量、培养基pH、孵育条件保持一致，只更换添加的营养组分。
3. 不耐高温的维生素、氨基酸母液采用滤膜除菌，不可高压灭菌，避免营养成分分解失效。
4. 平行样本分散排布在微孔板各个区域，规避边缘孔水分蒸发过快引发的系统误差。
5. 孵育全程舱门紧闭，温度、氧气波动会改变营养缺陷菌株的生理状态，干扰筛选结果。