一 实验目的
评价多种噬菌体组成的鸡尾酒复配体系对靶标致病菌的裂解杀菌效果，借助Bioscreen不间断浊度监测，记录单种噬菌体、不同组合复配噬菌体处理下细菌完整生长‑裂解‑复苏动力学；定量分析延滞时长、菌体浊度下降幅度、裂解持续时间、细菌反弹复苏情况，筛选具备协同杀菌效果的噬菌体组合，建立标准化的噬菌体鸡尾酒协同效果动力学评估方案。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 受试菌株、噬菌体与培养液
将靶标宿主细菌平板划线纯化，挑取单菌落多次传代活化。分别制备各类纯化噬菌体原液，测定每种噬菌体的效价。配制宿主细菌适用的液体基础培养基，高压灭菌备用。
实验分组设置空白培养基对照组、无噬菌体的细菌正常生长对照组、单一噬菌体处理组、多种噬菌体不同配比的鸡尾酒复配实验组。
2. 耗材以及仪器调试工作
准备原厂深井蜂窝微孔板、透气硬盖板，全部耗材经过高压灭菌之后晾干存放。
擦拭仪器上下光学检测窗口，清理残留菌体、培养基飞溅残渣；检查舱门密封胶条完好、腔体导热液处于标准液位。设备空载通电预热30 min，稳定氙灯光源输出和腔体内部温度场，规避长时间检测过程当中光路基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 宿主菌悬液与噬菌体工作液配制
挑取纯化后的细菌单菌落接入新鲜液体培养基，恒温摇床培养至对数生长期。菌体使用无菌缓冲液离心洗涤两次，清除旧培养基以及代谢产物，校准菌悬液浊度，保证所有组别细菌初始接种浓度保持一致。
将各个噬菌体原液进行梯度稀释，按照实验配比调配不同组合、不同体积比例的噬菌体鸡尾酒混合液。
2. 微孔板加样操作
于超净工作台内开展加样，单孔总体积固定为220 μL，依次添加无菌培养基、标准化细菌悬液、单种噬菌体或者复配噬菌体鸡尾酒。
每一组实验组设置6个生物学平行孔，分散排布空白孔、空白细菌对照组、各个单一噬菌体对照组、多组复配组合。蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水充当蒸发缓冲孔，减弱长时间孵育水分蒸发引发培养基浓度升高。
加样结束之后扣合原厂透气硬盖板，垂直按压卡扣锁紧，保障微孔通气，阻隔外界杂菌进入造成污染。
3. 仪器运行参数设置
设置靶标细菌适宜的恒温孵育温度，开启双层加热热盖，内层盖板温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8 ℃，防止水汽冷凝附着在光路盖板内侧。
开启间歇振荡程序，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后采集读数；振荡强度轻柔，只用来悬浮菌体，不会破坏噬菌体结构和宿主细胞。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，噬菌体裂解碎片、细菌代谢色素不会干扰菌体散射光检测；数据采集间隔设置15 min，整体监测时长充足，覆盖细菌增殖、裂解、抑制阶段以及后期细菌是否出现抗性复苏反弹。
4. 密闭长时间动力学监测
关闭仪器孵育舱门，全程密闭运行，监测阶段禁止开启舱门。设备自动连续记录所有微孔浊度变化曲线，得到各组完整的杀菌动力学曲线。
如果需要观测长期抗性菌复苏情况，可以持续监测数日，记录裂解之后菌体浊度回升时间。后续还可对复苏之后的抗性细菌取样，开展噬菌体抗性表型检测。
四 杀菌动力学指标与协同效果判定方法
1. 细菌裂解延滞期
从上机培养计时，对比对照组和噬菌体处理组菌体浊度开始下降的时间；复配鸡尾酒组裂解启动时间短于所有单一噬菌体组别，则代表存在协同加速裂解效果。
2. 最低谷底浊度
菌体裂解之后到达的最低浊度数值，谷底浊度越低，活菌清除效果越强；复配组谷底浊度显著低于单独噬菌体组别即为协同杀菌。
3. 裂解维持时长
记录菌体浊度维持在低水平的持续时间，时长越久代表可以长久压制抗性细菌增殖。
4. 细菌复苏反弹时间
观察裂解结束之后抗性菌株重新生长、浊度回升的时刻，鸡尾酒组合可以延后甚至阻止细菌复苏，降低抗性突变个体增殖概率。
5. 不同配比对比
对比多种噬菌体不同体积配比的动力学参数，筛选出协同效应最优的噬菌体配比方案。
五 实验收尾以及仪器养护
1. 监测任务结束之后导出全部原始浊度动力学数据，整理各组裂解延滞期、谷底浊度、抑制时长、复苏时间，绘制各组杀菌动力学曲线。
2. 微孔内含有致病菌与噬菌体的废液经过高压灭菌之后再进行处理；透气硬盖板清洗干净、高压灭菌之后收纳备用。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理水汽、菌体残渣，腔体自然风干之后关闭设备，定期检查舱门密封胶条老化以及污渍情况。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 全部实验组细菌初始浓度、噬菌体总效价、培养温度、振荡条件保持一致，仅改动噬菌体的组合与配比。
2. 噬菌体鸡尾酒现配现用，避免多种噬菌体长时间混合存放造成噬菌体活性下降。
3. 平行实验孔分散排布在微孔板各个区域，抵消板边水分蒸发、局部温度差异带来的板效应。
4. 孵育阶段舱门全程闭合，氧气、温度波动会改变细菌生理状态以及噬菌体侵染活性，干扰杀菌动力学结果。
5. 设置充足时长的观测周期，短时间监测容易漏掉后期抗性细菌复苏反弹现象，误判噬菌体鸡尾酒的长效抑菌能力。