一 实验目的
定量测定遭受噬菌体侵染之后细菌的恢复生长延滞期，探究噬菌体侵染遗留的后效作用对细菌复苏启动、增殖速度、最大菌体生物量带来的影响；借助Bioscreen高精度长时间动力学监测，建立标准化、可重复的延滞期定量检测方案，对比不同噬菌体侵染时长、侵染复数之下细菌生长表型差异，解析噬菌体后效对细菌种群复苏过程的调控特点。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 实验菌种、噬菌体以及培养基
将受试宿主细菌平板划线纯化，多次挑取单菌落活化培养。准备对应的烈性或者温和噬菌体，完成噬菌体滴度测定。配置细菌适宜的无菌液体基础培养基，所有培养基经过高压灭菌处理。
设置多组实验组，包含空白培养基对照组、未受噬菌体侵染的正常细菌对照组、不同感染复数、不同侵染处理时长的噬菌体‑细菌处理组。
2. 耗材以及仪器调试
准备原厂深井蜂窝微孔板、透气硬盖板，全部耗材高压灭菌之后晾干备用。
擦拭仪器上下光学检测窗口，清除残留菌体、培养基污渍；检查舱门密封胶条完好无损，腔体导热液维持正常液位。设备空载预热30 min，稳定光源输出和腔体温度场，防止长时间检测发生基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 宿主菌液和噬菌体工作液制备
挑取纯化后的细菌单菌落接入新鲜液体培养基，恒温摇床培养至对数生长期。菌体离心之后使用无菌缓冲液洗涤两次，去除代谢产物，调整细菌悬浮液初始浊度统一。
根据实验需要配置不同感染复数的噬菌体原液，提前做好梯度稀释。
2. 噬菌体侵染预处理
取等量标准化细菌菌悬液，加入对应浓度噬菌体，室温或者适宜温度条件下进行侵染孵育，设置梯度侵染时长。侵染结束之后可以采取离心洗涤，去除游离噬菌体，只保留已经遭受侵染后效应影响的细菌菌体。
对照组细菌加入同等体积无菌缓冲液，不添加噬菌体，其余处理条件保持一致。
3. 微孔板加样操作
超净工作台内完成加样，单孔培养液总体体积设置为220 μL。依次加入新鲜无菌培养基以及经过噬菌体预处理的细菌菌体。
各组设置不少于6个生物学平行孔，排布空白孔、正常细菌对照组、不同噬菌体处理实验组。蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水作为蒸发缓冲孔，缓解长时间孵育水分蒸发造成培养基浓缩。
加样完毕扣合透气硬盖板，按压卡扣锁紧，保证通气顺畅同时隔绝外界杂菌污染。
4. 仪器运行参数设定
设置宿主细菌适配的孵育温度，开启双层加热硬盖板，盖板温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8 ℃，防止水汽冷凝遮挡光路。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后采集浊度读数，柔和振荡让菌体均匀悬浮，避免菌体沉降干扰检测数值。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，规避噬菌体裂解碎片、细菌代谢有色物质产生的光学干扰；数据采集间隔设置15‑20 min，整体监测时长充足，直至所有组别细菌度过延滞期、完成对数增殖并且抵达平台期。
5. 全程密闭监测
关闭仪器舱门，整个监测阶段不再开启舱体。仪器自动连续记录全部微孔浊度变化曲线，获得各组细菌完整的复苏生长动力学。
如需探究长时间噬菌体遗留后效应，可以设置多代传代培养，持续追踪多代之后细菌延滞期能否恢复至正常水平。
四 生长动力学指标分析方法
1. 恢复生长延滞期定量读取
以接种完成作为计时起点，对比正常对照组与噬菌体处理组从接种直至浊度开始明显上升消耗的时长，二者的时长差值即为噬菌体后效引发的复苏延迟时间。统计多个平行孔延滞期数值，求取平均值和标准差。
2. 对数生长期最大生长速率
对比各组细菌增殖速率，判断噬菌体遗留损伤会不会降低细菌分裂速度。
3. 平台期饱和浊度
对比最终稳定菌体生物量，分析噬菌体后效是否造成种群最大容纳量下降。
4. 梯度侵染条件对比
对比不同感染复数、侵染时间对应的延滞期长短，明确噬菌体处理条件和细菌复苏延迟程度之间的剂量效应。
五 实验收尾和仪器养护
1. 监测结束之后导出全部原始浊度动力学数据，整理各组延滞期、生长速率、平台浊度，完成数据表整理和生长曲线绘制。
2. 微孔当中含有活菌以及噬菌体的培养液高压灭菌之后再进行废液处置；透气硬盖板清洗干净，高压灭菌之后收纳保存。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理水汽、菌体残渣，腔体自然风干之后关闭设备，检查舱门密封胶条状态。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 所有实验组和对照组细菌初始接种浓度必须保持一致，消除初始菌体数量干扰延滞期结果。
2. 游离噬菌体尽量通过离心洗涤去除，防止孵育阶段持续发生新的侵染，保证观测结果为前期侵染带来的噬菌体后效应。
3. 微孔平行样本分散摆放，规避微孔板边缘位置水分蒸发过快带来的系统误差。
4. 孵育全程舱门紧闭，温度、氧气变化会干扰细菌受损之后的复苏进程。
5. 噬菌体侵染孵育的温度、时长、缓冲体系全部统一，只改动感染复数等单一变量。