一 实验目的
借助Bioscreen高通量微孔长时间不间断监测功能，搭建微生物上千代适应性进化传代驯化体系，持续追踪菌株历经长期传代之后延滞期、最大生长速率、平台生物量、菌体沉降特性、胁迫耐受能力等生长性状的动态改变；区分环境胁迫筛选、自发突变、遗传漂变带来的表型分化，获取进化过程当中生长性状演化规律，建立可长期稳定运行、重复性强的上千代传代‑性状追踪标准化实验流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 实验菌株和驯化培养基
选用初始野生型亲本菌株，平板划线纯化三次以上，挑取单菌落活化，规避菌株初始杂菌污染、表型退化等问题。
配制基础驯化培养基，根据进化方向添加药物压力、营养匮乏、酸碱胁迫、高渗透压等选择压力；培养基经过高压灭菌，热敏类胁迫物质等待培养液降温之后再添加。同步配置无胁迫对照组培养基，用来排除多次传代本身引发的性状变异。
2. 耗材以及仪器调试
准备多份原厂深井蜂窝200孔微孔板、透气式原厂硬盖板，所有耗材高压灭菌之后烘干冷却，准备充足耗材供给上千代循环传代。
清洁仪器上下光学检测窗口，擦除菌体残渣、培养基飞溅污渍；检查舱门密封胶条完整无老化、腔体导热液液位达标。设备空载通电预热30 min，稳定氙灯光源输出、腔体温度与气流环境，防止长期监测出现光路基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 初代菌悬液制备
挑取纯化后的野生型单菌落接种至新鲜液体培养基，恒温摇床培养至对数生长期。无菌离心收集菌体，无菌缓冲液洗涤菌体两次，洗去旧培养液和代谢废物，校准菌液初始浊度，统一全部平行谱系起始菌体浓度。
2. 初代微孔板加样和密封
在超净工作台开展加样操作，单孔培养液体积固定为220 μL。微孔分区设置多条独立进化谱系、空白对照孔、无胁迫传代对照组；蜂窝板最外圈微孔装入无菌纯水作为蒸发缓冲孔，减弱长时间孵育水分蒸发造成培养基浓缩。
整块200孔蜂窝板可以同时建立多条独立平行进化谱系。加样结束扣紧透气硬盖板，卡扣完全咬合，保障通气条件同时阻隔外界杂菌入侵。
3. Bioscreen仪器运行参数设置
设置菌株最适孵育温度，开启双层加热温控，上层热盖温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8 ℃，避免水汽冷凝附着盖板内侧遮挡光路。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后采集信号；振荡强度柔和，只用来悬浮菌体，不会造成细胞机械损伤。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，抵御代谢色素、胁迫底物变色带来的检测干扰；数据采集间隔设定30 min，单次传代孵育时长依照菌株生长周期设定。
4. 循环传代驯化直至上千代进化
仪器舱门全程关闭，单次培养周期结束之后导出该一代全部谱系生长动力学曲线。
无菌环境之下，于菌体对数生长期按照固定稀释比例转接菌液，转移至装有全新胁迫培养基的灭菌蜂窝微孔板，开启下一代驯化培养。
严格固定转接时间、稀释倍数、培养条件，每间隔固定代数取出谱系菌体制备甘油保藏管，‑80℃低温封存各个时间节点的进化菌株，方便后续复测生长性状、耐药能力以及分子测序。
循环重复转接‑孵育‑数据采集‑菌种保藏整套流程，持续完成上千代的长期适应性传代。
无胁迫对照组菌株需要同步进行传代培养，用来对照区分胁迫环境筛选效应和传代自发突变。
5. 进化后期多梯度表型验证
驯化结束之后，调取不同世代保存的菌株，设置梯度胁迫浓度、营养环境上机检测生长曲线，对比亲本菌株、早期传代菌株、上千代进化菌株各项生长指标，定量解析生长性状演化趋势。
四 生长性状指标分析方法
1. 延滞期时长
胁迫环境之下初代菌株复苏缓慢、延滞期较长；伴随持续传代驯化，适应突变不断累积，延滞期逐步缩短，代表菌株环境适应能力提升。
2. 对数期最大生长速率
生长速率是核心适合度性状，随着适应性进化，菌株增殖速度慢慢回升；多条平行谱系之间生长速率出现差距，则代表进化当中产生表型分化。
3. 平台期饱和浊度
平台浊度对应菌株最大可到达的菌体生物量，能够反映菌株对于培养环境资源的利用能力。
4. 菌体沉降差异
借助振荡‑静置交替检测模式，获取静置前后浊度差值，监测长期进化之后菌体聚集、沉降性状的改变。
5. 胁迫耐受梯度测试
不同世代菌株设置多档胁迫浓度梯度培养，对比最低抑制浓度、耐受上限，评估抗逆性状的进化进程。
五 实验收尾和仪器养护
1. 上千代传代工作结束之后，汇总每一条进化谱系历代动力学原始数据，整理各项生长性状随传代次数变化的数据表格，绘制性状演化曲线。
2. 所有微孔内部活菌培养液经过高压灭菌之后再处理废液；透气硬盖板清洗除菌、高压灭菌之后收纳备用。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理水汽、培养基残留物，腔体自然风干之后关闭设备，定期检查舱门密封胶条损耗情况。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 每一代转接时间固定在对数生长期，稀释倍率、培养液体积、温度、振荡参数全程保持一致，规避人为操作变量干扰进化方向。
2. 胁迫类培养基现配现用，容易降解的活性物质避光配置，保证每一代选择压力稳定。
3. 多条平行进化谱系分散排布在微孔板各处，对照组穿插布设，抵消板边水分蒸发、局部温度差异造成的板效应。
4. 单次孵育监测期间舱门不可随意开启，氧气、温度波动会干扰菌株生长环境，造成进化环境不稳定。
5. 定期进行菌种保藏，防止长时间传代之后谱系丢失；设置空白传代对照组，区分胁迫诱导适应性性状和传代自发变异。