一 实验目的
依托Bioscreen单块深井蜂窝板200个独立微孔的高通量条件，搭建群体适应性竞争平行培养体系，设置大量独立竞争复刻种群，追踪不同菌株混合共培养环境下的生长动力学差异，对比单菌纯培养与混合竞争培养的延滞期、增殖速率、稳态生物量，量化菌株竞争适合度、种群适应分化，建立可批量复刻、可长期监测的微生物群体竞争演化操作流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 受试菌株、培养体系配置
准备参与竞争的多株受试微生物，平板划线纯化，挑取单菌落进行过夜活化。配制基础液体竞争培养基，可根据实验需求添加胁迫压力、代谢抑制物、群体感应信号物质。
提前设置纯培养对照组、多组不同初始接种比例的混合竞争组，所有培养基完成高压灭菌，热敏型添加剂在培养基降温之后再行添加。
2. 耗材、仪器检查调试
选用原厂200孔深井蜂窝板、可透气硬盖板，所有耗材高压灭菌之后晾干备用。
擦拭仪器上下光路检测窗口，清除菌体残渣、培养基污渍；检查舱门密封胶条完整，腔体导热液处在标准液位。设备空载通电预热30分钟，等待氙灯光源输出稳定、腔体内温度场均匀，防止后期长时间监测基线漂移。
三 标准化完整实验操作流程
1. 菌株活化与标准化菌悬液制备
挑取纯化后的单菌落接入新鲜液体培养基，恒温摇床培育至对数生长期。无菌条件下离心收集菌体，无菌缓冲溶液洗涤两次，洗去旧培养基和代谢产物。
使用分光光度计校准所有单菌菌液OD数值，统一菌体初始浓度；按照实验方案调配1:1、1:5、1:10等不同配比的混合竞争菌液。
2. 200‑微孔板分区排布和加样操作
在超净工作台内完成加样，单孔固定添加230 μL体系。蜂窝板采用分区排布方式，分散排布纯培养对照孔、多组平行竞争孔、空白培养基孔，避免板边效应带来的系统偏差，外圈全部微孔添加无菌纯水作为蒸发缓冲孔，降低长时间孵育水分蒸发浓缩。
整块200孔微孔可以设置上百组独立平行竞争种群，用来复刻群体随机演化。
加样结束以后扣合原厂透气硬盖板，垂直按压卡扣锁紧，保证微孔通气顺畅，隔绝外界杂菌污染。
3. 仪器运行参数设定
设置微生物适宜孵育温度，开启双层加热热盖，热盖温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8℃，规避水汽冷凝附着在盖板内侧遮挡光路。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s之后采集读数，振荡强度柔和，保障混合菌体均匀悬浮，不会破坏菌株细胞。
检测通道选用420‑580 nm原厂宽波段比浊通道，消除菌株代谢有色物质、培养基氧化变色造成的光学干扰；设置采样间隔20‑30 min，整体孵育时长根据竞争周期设定为72 h至十余天。
4. 平行种群竞争孵育、连续传代驯化
关闭仪器舱门全程密闭运行，实验期间禁止开启舱门。仪器自动采集200个微孔全程浊度动力学曲线。
需要开展多代适应性竞争传代时，待微孔菌体生长到达对数生长期，无菌吸取菌液，按照固定稀释比例转接至全新灭菌200孔蜂窝板新鲜培养基，开启下一代平行竞争培养。
每隔固定传代代数，分别留存每一条竞争谱系的菌体甘油保藏管，‑80℃低温保存，用于后续适合度复测、菌株表型和基因检测。
5. 后期分离验证
竞争结束之后，取各个微孔内混合菌体，在选择性平板进行涂布分离，分辨存活优势菌株、劣势菌株，统计200组平行复刻之下不同演化结局的出现频次，分析种群竞争过程当中的适应性分化规律。
四 生长动力学指标以及竞争适应性数据分析
1. 延滞期对比
对比单菌纯培养和混合竞争组延滞时长，受到异种菌株代谢物抑制的种群延滞期会明显加长；适应竞争环境之后子代菌株延滞期缩短。
2. 对数期最大生长速率
生长速率可以直接反映菌株在混合环境当中的增殖适合度，竞争优势菌株可以维持较高生长速率，劣势菌株增殖速度下降。
3. 平台期饱和浊度
稳态总生物量代表混合种群整体承载量，根据总浊度变化，判断菌株之间存在拮抗、共生或是资源争夺关系。
4. 200孔平行种群统计分析
统计全部独立微孔复刻样本，归纳不同平行谱系出现的多种适应表型，分析随机漂移、种间竞争驱动下群体适应性分化。
五 实验收尾和仪器养护
1. 结束监测之后导出整块200孔微孔板全部原始动力学数据，整理每一个平行竞争孔各项生长参数，完成数据表整理和曲线绘制。
2. 蜂窝板内部含有活菌的培养液经过高压灭菌再进行废液处理；透气硬盖板清洗干净、高压灭菌之后收纳存放。
3. 轻柔擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清理飞溅培养基残渣和水汽，腔体自然风干之后关闭仪器，检查舱门密封胶条完好程度。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 所有组别初始菌体配比、培养基成分、孵育温度、振荡参数保持统一，仅保留菌株组合作为单一变量。
2. 200孔微孔样本分散排布，对照组穿插在板上不同区域，抵消边缘孔水分蒸发、温度差异造成的板效应。
3. 传代转接时间固定在对数生长期，稀释倍率全程一致，防止菌体进入衰亡期干扰竞争驯化结果。
4. 长时间竞争培养全程关闭舱门，氧气、温度波动会改变菌株之间竞争平衡，造成平行样本重复性变差。