一 实验目的
依托Bioscreen高通量长时间动力学检测能力，探究不同浓度、不同种类群体感应QS信号分子对于受试菌株生长周期、菌体生物量、延滞时长以及增殖速率带来的影响，区分信号分子起到的促进或是抑制作用，摸索菌株响应群体感应物质的有效作用浓度，建立标准化可重复的QS‑菌株生长响应评价实验流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 实验菌株与试剂、培养基
将待测实验菌株进行平板划线纯化，挑取单菌落活化备用。配制菌株适宜的基础液体培养基，高压灭菌冷却之后，加入配制完成的各类群体感应信号分子母液，设置多组浓度梯度。
准备空白对照组培养基（不含QS信号分子）、溶剂对照组，消除溶解信号分子的有机溶剂本身对菌体产生的干扰。
2. 耗材和仪器调试准备
准备原厂深井蜂窝微孔板、透气型原厂硬盖板，所有耗材高压灭菌之后晾干待用。
清理仪器内部上下光路检测窗口，擦除残留培养基残渣以及灰尘；检查舱门硅胶密封圈完整无污渍，腔体导热液处在标准液位。设备开机空载预热30 min，等待氙灯光源输出稳定、腔体温度场均匀，正式开始上机实验。
三 标准化完整实验操作流程
1. 受试菌株菌悬液制备
挑取纯化后的单菌落接种至不含信号分子的基础培养液，恒温摇床培养至对数生长期。使用无菌缓冲液离心洗涤菌体两次，除去代谢产物以及原有培养液，之后调整所有组别菌体初始浓度保持一致，规避初始接种量差异干扰实验结果。
2. 微孔板加样操作
在超净工作台内开展加样，单孔总体积固定为220 μL。依次添加基础培养基、对应梯度浓度的QS信号分子溶液、标准化菌悬液。
实验分组包含空白培养基孔、溶剂对照组、多个信号分子浓度实验组，每组设置6个生物学平行重复孔。
蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水作为蒸发缓冲孔，降低长时间孵育过程当中培养液水分蒸发浓缩。
加样结束之后扣合透气硬盖板，按压卡扣卡紧，保障微孔通气顺畅，阻挡外界杂菌落入孔内造成污染。
3. 仪器各项运行参数设置
设置菌株适配的孵育温度，开启双层加热热盖，内层热盖温度高于孵育温度0.5℃‑0.8℃，防止腔体内部湿热空气遇冷起雾，遮挡光学检测窗口。
开启间歇振荡程序，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s再采集读数，振荡强度适中，保证菌体均匀悬浮同时不会损伤菌体细胞。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，信号分子氧化变色、菌体代谢产生有色物质不会干扰散射光检测结果。
设定检测采样间隔为20 min，整体孵育监测时长根据菌株完整生长周期设定，一般设置72 h以上，完整采集延滞期、对数生长期、稳定平台期、衰亡期全部阶段动力学数据。
4. 全程孵育监测
关闭仪器孵育舱门，全程密闭运行，实验期间不要随意开启舱门，防止温度、氧气波动改变群体感应响应效果。仪器自动不间断采集每一个微孔的浊度数值，生成各组菌株完整的生长动力学曲线。
5. 后续验证实验操作
初次浓度梯度筛选结束之后，挑选起明显调控效果的QS信号分子浓度，设置重复验证实验。还可增设不同培养时长取样，后续检测菌株自身内源群体感应物质的分泌水平，分析外源信号分子对内源QS系统的反馈作用。
四 生长动力学指标分析方法
1. 延滞期时长对比
对比溶剂对照组和各个实验组的延滞期。外源QS信号分子若是加快菌体复苏，实验组延滞期短于对照组；产生抑制效果则延滞期明显加长。
2. 最大生长速率
对数阶段生长速率代表菌体增殖快慢，用来判断群体感应物质对细胞分裂速度的调控效果，不同浓度梯度可以观察浓度依赖性促进或者抑制效应。
3. 平台期饱和浊度数值
平台期浊度对应培养液最大菌体生物量，据此判断QS信号分子最终能够承载的菌体种群上限。
4. 衰亡阶段变化
对比后期菌体浊度下降速率，分析群体感应信号分子会不会影响菌体稳定存活时间、菌体凋亡进程。
五 实验收尾以及仪器养护
1. 监测程序结束之后导出全部组别原始浊度数据，整理各项动力学参数，绘制不同浓度信号分子对应的生长曲线。
2. 蜂窝板当中含有活菌的培养液经过高压灭菌之后再处理废液，透气硬盖板清洗干净、高压灭菌之后存放。
3. 擦拭上下光学镜片、孵育腔体内壁，清除飞溅的培养基残渣和水汽，腔体自然风干之后关闭设备，检查舱门密封胶条完好情况。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 群体感应信号分子大多容易见光分解，配制含有QS物质的培养基全程避光操作，微孔板上机之后关闭仪器舱内光源。
2. 溶剂对照组必不可少，很多AHL、DSF类信号分子需要甲醇、二甲基亚砜等溶剂溶解，需要排除溶剂毒性干扰。
3. 全部组别初始菌液浓度、孵育温度、振荡参数、盖板类型保持统一，减少无关变量。
4. 长时间孵育阶段外圈纯水缓冲孔需要正常配置，防止水分蒸发造成信号分子浓度持续升高，引发实验误差。