一 实验目的
建立基于Bioscreen仪器的微生物耐药适应性演化连续传代方案，借助长时间生长动力学监测，追踪菌株在耐药压力环境下多代传代之后延滞期、生长速率、平台浊度、沉降特性等参数变化。对比亲本菌株和演化子代菌株的生长表型，解析微生物在药物胁迫环境当中的适应性进化规律，筛选获得耐药突变株，搭建标准化可复现的连续传代‑动力学监测技术流程。
二 实验材料与仪器前期准备
1. 实验菌株与培养基
准备原始野生型亲本菌株，提前进行纯化划线，挑取单菌落活化。配置基础液体培养基、添加亚抑菌浓度耐药药物的胁迫培养基，设置多个药物浓度梯度，用来施加选择压力。所有培养基完成高压灭菌，冷却之后再添加不耐高温的抗菌药剂。
2. 耗材和仪器检查调试
准备原厂深井蜂窝培养板、透气密封硬盖板、无菌吸头。全部耗材灭菌处理。
清理仪器上下光学检测窗口，擦除残留菌体以及培养基污渍，检查舱门密封胶条完好无损，腔体导热液处于正常液位。设备通电预热30分钟，稳定氙灯光源输出和腔体温度，消除光路基线漂移问题。
三 标准化完整实验操作流程
1. 初代菌株活化以及起始菌液制备
挑取纯化后的单菌落接种至无药物基础液体培养基，恒温摇床培育至对数生长期。菌体离心之后使用无菌缓冲溶液清洗两次，去除旧培养基残留，调节全部组别初始菌体浓度至统一数值。
2. 初代传代微孔板加样封板
在超净工作台开展加样操作，单孔添加230 μL含有对应药物浓度的胁迫培养基，接入配置完成的菌悬液。每组药物梯度设置6组生物学平行孔，设置空白培养基对照孔。蜂窝板外圈微孔装入无菌纯水充当蒸发缓冲孔，减缓长时间孵育时水分蒸发浓缩。
扣上原厂透气硬盖板，按压卡扣直至完全锁紧，保障气体流通同时隔绝外界杂菌污染。
3. Bioscreen仪器运行参数设定
设置该微生物适宜的孵育温度，开启双层加热热盖，内层盖板温度高于腔体温度0.5‑0.8℃，防止腔体内部水汽起雾遮挡光路。
开启间歇振荡模式，每次浊度检测之前振荡90 s，静置30 s，除去微孔内部气泡，让菌体均匀悬浮，振荡转速不宜过高，避免菌体细胞受到机械损伤。
检测通道选用420‑580 nm宽波段比浊通道，规避药物分解、代谢色素带来的光学干扰，数据采集间隔设置30 min。
4. 单代培养结束，完成连续传代转接
单轮孵育结束之后导出该代完整生长动力学曲线。在无菌环境吸取处于对数生长期的菌液，按照统一转接比例，转接到含有同等药物浓度全新胁迫培养基当中，开启下一代的胁迫驯化。
每一代都需要使用全新灭菌蜂窝板，重复加样、封板、上机监测整套流程。
全程设置无药物空白驯化对照组，亲本菌株同步传代，排除多次传代本身造成的生长性状改变。
依照实验需求持续进行15代至50代的连续胁迫传代驯化。
5. 不同世代菌株保存
每隔固定传代代数，取出菌体制作甘油保藏管，‑80℃冷冻留存各代演化菌株，方便后续开展耐药能力复测、基因检测和表型验证。
四 生长动力学指标分析以及适应性演化判断方式
1. 延滞期变化
初代受药物胁迫之后菌株延滞期很长，随着不断传代驯化，延滞期慢慢缩短，代表菌株已经逐步适应药物压力，休眠复苏速度加快，产生适应性突变。
2. 最大生长速率
对比每一代菌株最大生长速率，当生长速率逐步回升至接近无药对照组水平，说明菌株已经演化出良好的药物耐受能力。
3. 平台期饱和浊度
受药物抑制时菌体最大生物量偏低；适应性演化成功之后平台浊度上升，菌体可以在耐药胁迫环境下正常增殖。
4. 设置梯度药物耐受验证
驯化结束之后，设置多个抗菌药浓度梯度，上机检测亲本菌株、多代驯化菌株的生长曲线，确定菌株最低抑菌浓度的上升幅度，评估耐药适应性演化程度。
五 实验收尾和仪器日常养护
1. 全部传代驯化工作结束之后导出所有世代原始动力学数据，整理每一代延滞期、生长速率、平台浊度，制作演化趋势数据表。
2. 蜂窝板内部含有活菌的培养液经过高压灭菌之后再做废液处理，透气硬盖板清洗灭菌之后存放。
3. 仔细擦拭检测镜片、孵育腔体内壁，清理水汽、培养基飞溅残留物，腔体风干之后关闭仪器，检查舱门密封圈状态。
六 实验质控要点以及注意事项
1. 每一次传代转接的时候菌液转接比例保持恒定，转接时间统一选在对数生长期，防止菌体进入衰亡阶段影响驯化效果。
2. 药物培养基现配现用，容易降解的药剂避光保存，避免药物活性下降造成选择压力不稳定。
3. 高温、剧烈振荡、中途开启舱门都会干扰菌体生长状态，长时间监测阶段舱门全程闭合。
4. 需要设置无药物传代对照组，区分药物胁迫诱导的适应性性状和多次传代带来的自发变异。