一、实验目的
依托Bioscreen一体化孵育‑振荡‑检测的高通量性能，大批量筛查不同合成生物学底盘菌株、质粒组合、调控元件的生长动力学表型；筛选出增殖速度快、延滞期短、生物量产出高、环境稳定性优异、外源载体负担低的优质底盘菌，同时排查质粒负载引发的生长缺陷，为后续人工基因回路搭建、产物合成筛选提供合适的宿主菌株。
二、实验前期材料和仪器准备
1. 菌株与质粒制备
准备全部待筛选底盘宿主，包含野生型本源菌株、基因编辑改造菌株、不同敲除组合底盘菌；同时准备空载质粒、人工合成基因回路重组质粒。
所有底盘菌株单独划线纯化，挑取单菌落连续两代液体活化，消除菌种休眠、传代差异；活化至对数中期之后离心洗涤，新鲜无菌培养基重悬，统一调节全部菌液初始浊度，保证每组初始接种菌量一致。
按照实验需求完成质粒转化，获得全部转化后的工程底盘菌，设置空白宿主、空载质粒对照组，用来扣除质粒载体本身带来的代谢负担。
2. 培养基与耗材准备
配置基础发酵培养基、胁迫筛选培养基，可设置营养匮乏、酸碱压力、高渗透压等环境条件，筛选抗逆性能良好的底盘；准备原装深井蜂窝板、适配硬盖板。
好氧型底盘菌配备透气滤膜盖板；厌氧、兼性厌氧底盘选用密闭硬盖板；蜂窝板最外圈微孔添加无菌纯水作为湿度缓冲孔，缓解长时间孵育培养基水分蒸发浓缩。
3. 仪器预检工作
使用无尘纸擦拭上下光路检测窗口、孵育腔体内部，清理残留菌液、灰尘、冷凝水渍；检查舱门硅胶密封圈、腔体导热液液位、滤光轮转动、振荡托盘运行状态。
设备开机空载预热40 min，等待氙灯光源输出稳定之后执行光路基线校准，排查基线漂移问题，保障大批量微孔浊度检测稳定性。
三、微孔排布、加样以及封板操作
1. 微孔排布规划
采用随机化排布方式放置待测样品，抵消腔体内部局部温度、气流差异造成的系统误差。
微孔分区设置无菌培养基空白对照组、无质粒野生底盘对照组、空载质粒对照组、大批量不同改造底盘‑重组质粒实验组；每一组样品设置不少于5个生物学重复。
各个微孔加入200‑250 μL灭菌培养基之后接入等量已经调好浓度的工程菌悬液；外圈微孔只添加无菌纯水。
可在单块蜂窝板内部同时排布几十组不同底盘菌株，实现高通量并行筛选。
2. 盖板密封以及装板
根据底盘菌氧气代谢类型选择盖板，卡扣按压锁紧；透气盖板的除菌滤膜不可沾染上培养液，防止通气通道堵塞。
将蜂窝板平稳放置在加热振荡托盘之上，板面和托盘完全贴合，关闭孵育舱门，正式开始检测。
四、仪器各项运行参数设置
1. 孵育温控参数
参照底盘菌最适生长温度设定孵育温度；开展抗逆筛选时设置多组梯度温度、pH胁迫环境。
内层加热热盖温度高于腔体孵育温度0.5‑0.8 ℃，高温条件上调温差，避免水汽凝结起雾遮挡光路。
2. 间歇振荡参数
开启间歇振荡模式，每次浊度采集之前振荡60‑90 s，让菌体充分悬浮，规避菌体沉降带来浊度读数偏低；振荡结束静置30 s，散去微孔当中气泡之后再执行检测。
对于菌体较为脆弱、携带大型重组质粒的底盘菌株，降低振荡转速，减轻机械剪切压力。
3. 光学检测通道与扫描周期
透明培养基选用600 nm单波长通道；含有色素、发酵杂质、有色底物的培养基启用原厂420‑580 nm宽波段比浊通道，规避基质颜色干扰。
普通原核底盘菌扫描间隔设置15‑20 min；生长缓慢的真核底盘菌设置30 min采集一次动力学数据。
整体监测时长覆盖延滞期、对数生长期、平台期以及衰亡阶段；开启空白孔实时基线校正，消除培养基氧化、沉淀引发基线偏移。
五、高通量筛选期间过程管控
整个筛选周期孵育舱门保持关闭，禁止频繁开盖，防止温度波动、杂菌污染、水分流失。
定时远程查看全部微孔生长曲线，初步筛除延滞期过长、最大生长速率低下、最高生物量很低、过早进入衰亡期的劣质底盘菌株。
当一次需要做多块蜂窝板高通量筛查，每隔24 h调换两块蜂窝板摆放位置，平衡腔体温度差异。
一旦腔体内部出现薄雾，上调内层热盖加热温度，等待水汽挥发消散后继续监测。
六、生长表型数据分析与优良底盘筛选标准
1. 提取全部动力学参数
导出所有微孔原始浊度数据，获取延滞期时长、最大比生长速率、峰值生物量、平台持续时长、衰亡速率。
2. 底盘菌分级筛选标准
优质底盘：对比野生宿主和空载对照组，菌株延滞期短、生长速率高、峰值生物量充足，携带重组质粒之后生长负担微弱。
一般底盘菌：基础生长状态正常，但搭载外源质粒之后生长速率明显下降，质粒代谢负担较重。
不合格底盘：延滞期很长、菌体增殖缓慢、平台期生物量低，不适用于外源基因回路表达。
3. 统计学筛选
各组生物学重复开展方差分析，筛选出和对照组相比生长性能具备显著性优势的底盘菌株；胁迫组筛选出在压力环境依旧能够稳定增殖的抗逆底盘。
七、实验收尾、菌株保藏以及仪器养护
导出全部生长动力学原始数据和生长曲线图谱；腔体冷却至室温之后开启舱门，取出蜂窝板。
性能优异的待测底盘菌及时划线分离单菌落，进行菌种保藏；废弃菌液高压灭菌之后再处理。
拆开硬盖板清洗灭菌；擦拭孵育腔体、光路镜片、振荡托盘的污渍和水汽；检查密封胶条损耗，设备冷却之后关机。
八、高通量筛选质控要点
1. 全部实验组和对照组初始接种浓度、培养基、温度、振荡参数、盖板类型保持统一，只更换底盘菌株和重组质粒变量。
2. 大批量筛选时优先启用宽波段检测通道，消除发酵基质色素、代谢产物带来的检测干扰。
3. 设置充足生物学重复，剔除菌体沉降、偶然污染造成的异常微孔数据。
4. 长时间孵育依靠外圈纯水孔稳定腔体湿度，防止培养液水分浓缩改变培养基组分。