一、实验目的
借助Bioscreen长时间高通量浊度监测功能，检测必需基因CRISPR条件致死突变株在多种温度梯度环境之下的完整生长曲线；对比野生型菌株、空载对照组，确认突变体在适宜温度可以正常存活，非许可高温或者低温环境出现生长停滞、菌体死亡，从而验证该基因为微生物条件‑致死型必需基因，筛选出致死临界温度、分析温度对于菌株生长动力学参数的影响。
二、实验前期材料和仪器准备
1. 菌株准备
设置三组受试菌株，野生型原始菌株、空载编辑对照菌株、必需基因条件致死CRISPR突变菌株。
所有菌株提前平板纯化，挑取单菌落连续两代液体活化，消除休眠菌体和活化差异；活化至对数中期之后离心清洗，新鲜培养基重悬，全部样品调整至一致的初始浊度，保证接种菌量统一。
如果受试菌株属于厌氧真菌或者厌氧菌，全部接种流程需要在厌氧操作台内操作。
2. 培养基与耗材准备
准备基础液体培养基，可配置多份相同培养基排除批次误差；准备原装深井蜂窝板、适配硬盖板，好氧菌选用透气滤膜盖板，厌氧菌选用密闭密封盖板。外圈微孔预留无菌纯水当作蒸发缓冲孔，降低长期孵育水分浓缩。
3. 仪器预检工作
擦拭仪器上下光路镜片、孵育腔体，清除菌渍和浮尘；检查舱门密封胶条、冷却液液位、滤光轮运转状态。设备空载预热40 min，氙灯光源输出稳定之后执行光路基线校准。
本次实验需要梯度温控，提前确认仪器温控系统可以精准切换、稳定维持各个设定温度。
三、微孔排布、加样以及封板操作
1. 微孔排布规划
一块蜂窝板之内划分多个温度组别，采用随机排布方式，规避腔体局部温度偏差带来系统误差。
设置空白培养基孔、野生型重复孔、空载对照孔、条件致死突变株孔；每组最少设置6个生物学重复，用来后续统计学检验。
每一个微孔加入220 μL灭菌培养基，之后接入等量调好浓度的菌悬液。最外圈全部添加无菌纯水缓冲。
2. 密封盖板安装
按照菌株氧气需求扣合盖板，卡扣完全压紧，通气滤膜不能被培养液污渍堵塞；厌氧菌株扣紧密闭硬盖板，必要时培养液表层添加无菌矿物油隔氧。
蜂窝板安放至加热托盘之上，板面和托盘完全贴合，关闭孵育舱门。
四、仪器参数设置，多‑温度梯度实验组搭建
1. 温度梯度设置
根据菌株特性设置梯度温度，包含许可适宜温度、过渡温度、限制性致死温度。
举个示例：适宜28 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃、41 ℃；条件致死突变株只能够在低温正常增殖，高温环境下生长受阻。
分批次运行或者使用两台蜂窝板并行开展不同温度组别实验，单次运行只固定一个孵育温度，保证整块板温度环境统一。
2. 双层热盖防冷凝参数
内层热盖温度始终高于孵育温度0.5‑0.8 ℃，高温组别上调温差至0.8 ℃，抑制高温环境水汽蒸发之后腔体起雾，防止水雾遮挡光路。
3. 振荡参数
开启间歇振荡，每次读取浊度之前振荡90 s，之后静置30 s散去微孔内部气泡再检测；条件致死突变体菌体较为脆弱，振荡档位调低，避免机械损伤菌体。
4. 光学检测通道和扫描周期
培养基清澈透明选用600 nm单波长通道；有色、带有沉淀物的培养基开启420‑580 nm原厂宽波段比浊通道。
普通细菌扫描间隔15‑20 min，生长缓慢真菌设置30 min采集一次；整体监测时长充足，完整覆盖延滞期、对数生长期、平台期、菌体衰亡阶段。
开启空白孔实时基线校正，抵消培养基氧化变色造成基线漂移。
五、实验过程管控
实验期间孵育舱门全程关闭，禁止中途开启，防止温度波动、外界杂菌污染以及水汽流失。
定时远程查看各组动力学曲线，记录突变株和对照组在各个温度之下的生长走向。
适宜许可温度下条件致死菌株生长曲线与野生型基本接近；到达限制温度，突变株延滞期大幅拉长、最大生长速率下降、最高浊度很低甚至浊度逐步下降，代表菌体发生死亡。
切换不同温度组别实验之前等待腔体温度充分恒温稳定之后再放入蜂窝板样品。
一旦腔体内部出现薄雾，上调内层热盖温度直至水汽挥发干净，再继续采集数据。
六、后期数据处理和致死表型验证标准
1. 提取动力学指标
导出全部原始浊度数据，分别获取延滞期时长、最大比生长速率、峰值生物量、平台期维持时长、衰亡速率。
2. 表型判定标准
许可温度：条件致死突变株各项生长动力学参数，和野生株、空载对照组没有显著差异，菌株能够正常增殖存活。
临界过渡温度：突变株生长速率下降、延滞期延长，生长表现弱于对照组。
限制性致死温度：突变株几乎没有明显的对数生长期，峰值浊度长期处在初始水平或是后期浊度回落下降，菌体停止增殖并逐步死亡；野生菌株在此温度依旧能够正常生长。
3. 统计学分析
各组重复样本开展方差分析，对比突变株和对照组之间生长参数差异显著性，排除随机误差，证实该必需基因具备温度依赖性条件致死特性。
七、实验收尾以及仪器保养
保存全部温度梯度下的生长动力学曲线原始文件；等待腔体冷却至室温之后开启舱门取出蜂窝板。
所有菌液高压灭菌之后再丢弃；硬盖板拆开清洗、高压灭菌晾干备用。
清理孵育腔体、光路镜片的水汽与残留污渍；检查密封圈损耗情况，仪器空载冷却之后关机。
八、关键质控要点
1. 所有组别初始接种菌浓度、培养基配方、振荡参数、盖板类型保持一致，只改动孵育温度单一变量。
2. 高温孵育环境水汽挥发更快，外圈纯水缓冲孔需要做好湿度缓冲，防止培养液浓缩。
3. 弱致死表型容易被沉降、色素干扰，有色培养基务必启用宽波段比浊通道检测。
4. 设置充足生物学重复，区分温度压力带来的随机生长波动和真实条件致死表型。