一、实验总体设计与单日通量逻辑
本方案基于芬兰Bioscreen 200孔全自动动力学监测平台，搭建单日200个化合物样品的多靶点高通量抑菌初筛体系，适配细菌、真菌多靶点菌株筛选，可同步完成化合物广谱抑菌活性、生长抑制动力学初步定性定量评价。整套方案通过批量预制试剂、标准化分液流程、无间歇上机排布、精简平行设置，实现单日满通量样品检测，同时保留基础质控体系，规避高通量筛选常见假阳性、假阴性问题。
核心通量设计逻辑：利用单台Bioscreen单轮完整24 h监测周期，搭配前期集中样品预处理、试剂批量配制、统一加样流水线，单仪器单日可稳定完成200个单一浓度化合物初筛；若需梯度筛选，可拆分样品批次适配仪器时序，初筛阶段统一采用单一有效筛选浓度快速锁定活性候选化合物，后续复筛再做梯度MIC验证。
实验核心分组：200个待测化合物样品孔、配套空白对照、溶剂对照、阳性药物对照、无药生长对照，所有样品单重初筛、阳性样品后续复筛，兼顾筛选效率与科研可靠性。
二、实验前期批量预处理（单日筛选前置准备）
1. 化合物样品标准化预处理
统一收集200个多靶点待测化合物，包含天然产物、合成小分子、中药单体、复合提取物等各类样本，统一配制母液。水溶性化合物用无菌MH肉汤溶解，脂溶性化合物用无菌DMSO溶解，所有样品经0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，杜绝样品自带杂菌污染。
统一设置初筛固定浓度，常规化合物初筛终浓度设置64 μg/mL，天然提取物、中药复方初筛终浓度设置128 μg/mL，保证覆盖绝大多数抑菌活性区间，避免浓度过低漏筛、过高产生非特异性毒性。所有化合物溶剂终浓度统一控制在0.5%以内，消除溶剂统一抑菌干扰。
提前1天完成所有200个样品的稀释、分装、标记，按微孔板孔位顺序排序，做好孔位对应台账，大幅缩短当日上机操作时间。
2. 培养基与菌株批量制备
根据筛选靶点菌株类型，批量配制无菌MH肉汤（细菌）或RPMI 1640肉汤（真菌），单次配制足量培养基，避免批次误差。培养基121℃高压灭菌20 min，冷却后室温静置脱泡4 h，保证上机无气泡干扰。
靶点菌株提前1天活化，挑取单菌落过夜培养，次日转接传代1次，保证菌株处于标准对数生长期。实验当日用0.5麦氏浊度标准校准菌液，细菌稀释至终浓度5×10⁵ CFU/mL，真菌稀释至2×10⁶ cells/mL，全程冰上避光保存，维持菌液浓度稳定。
多靶点筛选需同步准备多种测试菌株，每种菌株单独配制菌悬液、单独排布板位，台账清晰区分不同靶点菌株对应的化合物样品。
3. 仪器与耗材前置预检
提前30 min开启Bioscreen仪器预热，清洁孵育舱、光路窗口、托盘积水与残留菌斑，执行全自动光路基线校准，确认600 nm光路读数稳定、温控均匀、间歇振荡功能正常。关闭电脑、仪器、硬盘自动休眠功能，接入UPS不间断电源，保障24 h连续监测无中断。
准备原厂200孔蜂窝板1块，检查板底透光面无划痕、污渍、残留色素，配套原厂防蒸发盖板与透气封板膜，满足单日满板通量筛选需求。提前整理移液枪、无菌枪头、无菌离心管等耗材，实现流水线式加样操作。
三、单日200样品标准化加样与板位排布方案
1. 微孔板孔位整体排布规则
整块200孔蜂窝板全部利用，其中200孔全部用于待测化合物样品，对照孔采用固定边缘排布模式，不占用样品孔位，最大化利用通量。板位采用棋盘交错排布，不同靶点菌株样品交叉分散，避免同类型菌株集中排布造成的局部培养误差。
板体四周最外侧孔统一设置为缓冲孔与质控对照孔，包含无菌空白对照、溶剂空白对照、无药菌株生长对照、阳性抑菌药物对照，每类对照设置3重平行，保证整板数据校正有效。
2. 标准化批量加样流程
单孔固定终体积250 μL，采用统一流水线加样顺序，先加入125 μL恒温平衡无菌肉汤，再加入50 μL预处理完成的化合物工作液，最后加入75 μL标准化菌悬液，保证每孔体系配比统一，规避加样顺序误差。
每加完一行孔位，轻柔吹打3次混匀，逐孔排查并清除液面微小气泡，防止气泡造成光路噪声、曲线异常。全程快速加样，单块200孔板加样总时长控制在40 min以内，保证所有样品菌株起始生长状态一致。
3. 封板与上机预处理
加样完成后，立即加盖原厂防蒸发盖板，沿板体四周粘贴半透气封板膜，保留微量气体交换通道，避免24 h培养过程中水分蒸发、体系浓缩导致的假阳性抑菌结果。
使用无尘纸巾单向轻柔擦拭板底透光面，去除水渍、指纹、残留培养基，保证光路透光均匀，无杂峰干扰。平稳将蜂窝板完全卡入仪器卡槽，确认卡扣锁紧、舱门传感器正常触发。
四、高通量监测参数统一设置（适配200样品同步检测）
1. 基础培养与扫描参数
根据靶点菌株设置统一培养温度，细菌35±2℃，真菌28℃；开启低速间歇振荡模式，避免菌体沉降，保证200孔菌体悬浮状态一致，消除沉降带来的生长曲线偏差。
固定检测波长600 nm，读数间隔20 min，总培养时长24 h，完整覆盖菌株延滞期、对数生长期、平台期，可精准捕捉化合物的弱抑制、延迟抑制、短期抑菌等不同作用表型。
2. 数据校正与保存设置
开启整板统一基线校正，依托板内空白对照、溶剂对照逐时间点扣零校正，消除化合物色素、溶剂、培养基底色浊度干扰，适配中药、天然产物等复杂样品筛选。
设置数据实时自动保存，每轮扫描自动写入CSV格式原始数据，全程缓存备份，杜绝高通量数据丢失。完成10 min预扫描，确认整板基线平稳、无异常波动后，启动全自动24 h连续监测。实验全程禁止开盖、修改参数、插拔通讯线缆。
五、高通量数据快速筛选与活性判定标准
1. 数据预处理与降噪
监测结束后，一键导出整板200个样品的全部时序OD原始数据并备份。通过配套空白对照完成基线校正，采用窄窗口移动平均滤波平滑曲线毛刺，批量剔除污染、沉降、漂移异常的无效样品孔，记录无效样品编号，便于后续补筛。
2. 初筛活性定量判定规则
以板内无药菌株生长对照为基准，计算每个化合物样品的生长抑制率，抑制率基于曲线下总面积AUC计算，保证动态定量准确性。抑制率≥50%判定为初筛活性候选化合物，抑制率30%～50%判定为可疑活性样品，抑制率＜30%判定为无抑菌活性样品。
同步结合生长曲线形态辅助判定，存在明显延滞期延长、生长速率大幅下降、平台期OD显著降低的样品，即使抑制率略低于50%，也纳入可疑候选队列，避免漏筛弱活性多靶点化合物。
3. 高通量初筛分级归类
将200个样品快速分为三类：高活性样品、可疑活性样品、无活性样品。高活性样品直接进入后续梯度MIC复筛、动力学拟合、协同机制验证；可疑样品独立复测确认活性；无活性样品归档剔除，大幅缩减后续实验工作量。
六、高通量筛选质控与误差控制
1. 整板质控标准
无药生长对照菌株生长曲线正常、无明显波动，无菌空白与溶剂空白全程无浊度上升，阳性药物对照抑菌效果稳定，整板数据判定有效。若对照异常，整块板200个样品数据作废，重新筛选。
2. 高通量专属误差防控
严格统一所有样品加样量、菌液浓度、培养条件，消除批量操作误差；所有化合物样品预处理体系一致，溶剂浓度统一，避免溶剂差异导致的假阳性结果；全程低温避光保存菌液，防止加样过程中菌体提前增殖，保证200孔起始菌量均一。
七、实验收尾与高通量数据归档
1. 耗材与仪器处理
实验结束后，取出蜂窝板，所有含菌株、化合物废液统一高温高压灭菌处理，一次性蜂窝板直接丢弃，避免残留样品交叉污染。
清洁仪器孵育舱内壁、托盘、光路窗口，敞开舱门通风干燥2 h以上，执行光路基线校准，清空自定义实验参数，恢复仪器出厂默认状态。
2. 批量数据归档
完整归档200个样品原始时序OD数据、孔位排布台账、化合物信息表、活性抑制率统计结果、异常样品记录、质控对照数据，形成全套可溯源、可复现的高通量筛选数据档案，满足SCI论文数据溯源与批量筛选结题要求。