一、Bioscreen配套实验标准化采集方案（拟合前置必备）
1. 菌株、培养基与梯度设计
待测菌株新鲜活化两代，调整至标准接种浓度，细菌5×10⁵ CFU/mL，真菌2×10⁶ cells/mL。
抑菌物质设置不少于6个连续二倍梯度，覆盖完全无抑制至完全抑制区间，梯度数量优先采用7～9组保障拟合收敛；每组梯度设置3重技术平行，整套实验完成3次生物学重复。
配套对照：无药阳性生长对照、无菌空白肉汤、溶剂空白对照，用于基线校正。培养基添加缓冲盐稳定pH，上机前恒温平衡，消除体系漂移。
2. Bioscreen上机参数规范
检测波长600 nm，读数间隔20 min；细菌培养24 h，真菌延长至48～72 h；全程开启低速间歇振荡，降低菌体沉降干扰。
单孔体积200～250 μL，加盖原厂防蒸发盖板，减少长时间培养水分浓缩造成浓度偏移。实验全程禁止中途开盖，时序数据导出为CSV原始文件。
二、原始数据预处理（拟合前清洗流程）
1. 基线校正
利用无菌空白、溶剂空白逐时间点扣减基线OD，消除培养基、药物色素、溶剂自带浊度。不校正直接拟合会造成NIC、MIC系统性偏移。
2. 计算TTD检出时间
统一设定检出阈值OD（常用校正后OD=0.2），对每条时序生长曲线插值计算到达阈值对应的时间TTD；完全无法达到阈值的高抑制组，TTD设定为实验总时长上限。
计算RTD=1/TTD作为模型拟合响应变量。
若选择AUC作为响应指标，则以无药对照组AUC为基准计算相对生长指数GI，同样可代入修正版Lambert-Pearson模型拟合。
3. 离群样本剔除规则
同一梯度3个平行RTD变异系数大于20%，排查气泡、污染、沉降；标记离群孔并剔除，禁止随意删减数据。剔除数量超过一组平行，该梯度整组复测。
4. 数据格式整理
整理数据表列：浓度x、log₁₀(x)、平行编号、RTD；导入Origin、GraphPad Prism、R语言非线性拟合工具。
三、完整非线性拟合分步操作教程
1. 拟合初始参数设定
P₀初值：直接采用无药对照组RTD均值；
P₁初值：预估介于NIC与MIC中间的浓度；
P₂初值：初始赋值2～4，天然提取物可下调至1.5；
参数约束：P₀>0，P₁>0，P₂>0，防止拟合出现无生物学意义负数解。
2. 拟合运算设置
选择最小残差平方和（RSS）作为优化目标，非线性迭代最大迭代次数设置≥1000；收敛标准设置10⁻⁶。
优先使用L-M（Levenberg-Marquardt）迭代算法，避免局部最优陷阱。
3. 拟合质量判定标准
决定系数R²≥0.92，方可认定拟合有效；
参数95%置信区间不跨零；
拟合曲线可以平滑穿过全部梯度实验数据点；
若出现震荡、无法收敛，采取两种方案：增加浓度梯度组数、调整初始参数初值、剔除极端离群梯度。
4. NIC、MIC计算与置信区间推算
利用收敛后的P₀、P₁、P₂带入公式计算NIC与MIC；借助软件参数协方差矩阵，通过误差传递计算NIC与MIC的95%置信区间。
仅输出单点NIC/MIC数值不规范，论文中必须附带置信区间。
四、拟合结果判读与常见问题排查
1. 结果生物学解释
NIC至MIC区间：菌株生长随浓度升高持续被抑制；
浓度＜NIC：抑制效应可以忽略；
浓度＞MIC：生长基本完全阻滞；
P₂数值越大，剂量响应曲线越陡峭，菌株对抑菌物质浓度变化越敏感。
2. 典型拟合失败原因
梯度区间设置不合理，未同时覆盖无抑制与完全抑制两端；
菌体沉降造成TTD失真，振荡参数不足；
中药提取物色素干扰基线，未做溶剂空白校正；
存在拖尾迟发生长，曲线不满足模型单调下降假设；
平行重复变异过大，数据噪声过高。
3. 与传统终点MIC对比说明
LPM拟合MIC为基于全周期动力学的统计阈值；传统肉眼终点MIC依赖单一时间点判定。二者数值允许相差1个二倍梯度，属于正常现象；论文建议两种方法同时列出相互佐证。
五、绘图规范与SCI论文呈现要求
1. 绘图坐标轴
X轴：抑菌物质浓度（建议log₁₀浓度）；Y轴：RTD或者相对生长指数GI。
叠加原始实验散点、非线性拟合实线，在曲线上标注拟合得到NIC、MIC对应横坐标位置。
2. 附表要求
补充表格列出P₀、P₁、P₂拟合值、95%置信区间、R²、NIC、MIC及其置信区间。
3. 方法部分描述模板
采用Lambert-Pearson抑菌动力学模型对Bioscreen时序浊度数据进行非线性拟合，以TTD检出速率RTD作为响应变量，L-M算法最小化残差平方和；由收敛参数计算NIC非抑制浓度与MIC最小抑制浓度，拟合质量由R²评价。
六、实验收尾与数据归档
导出Bioscreen原始时序OD、校正后数据表、TTD计算表、拟合工程文件、拟合参数报告、绘图源文件。
完整保存梯度配制记录、菌株活化记录，保证拟合过程全部可复现。仪器腔体清洁、光路校准按照Bioscreen常规流程执行。