一、实验前期材料与对照标准化设计
1. 菌株、复合抗菌组分预处理
选取目标测试菌株与标准质控菌株，野生菌株、无药空白组作为基础参照。两种复合抗菌物质分别配制无菌母液，水溶性成分使用肉汤溶解过滤除菌，脂溶性组分采用低浓度DMSO助溶，溶剂终浓度控制0.5%以内避免非特异性干扰。
提前单独测定两种单体物质各自MIC，以此为基准设置协同实验浓度区间，每种物质设置6个梯度浓度，覆盖0～2倍MIC范围，构建二维浓度组合矩阵，完整覆盖低浓度联用、等比例联用、高浓度联用全部区间。
每组组合设置3重技术平行，整套实验独立开展3次生物学重复，保证等高线拟合数据统计学可靠。同步设置五类对照：无药正常生长对照、无菌空白肉汤、溶剂空白对照、物质A单独梯度对照、物质B单独梯度对照。
2. 基础培养基配制
统一批量配制MH肉汤（细菌）或RPMI 1640肉汤（真菌），添加缓冲盐稳定全程pH，避免复合提取物有机酸、生物碱改变酸碱度干扰协同效应。培养基121℃高压灭菌20 min，冷却至室温静置充分除泡，上机前恒温平衡至培养温度，减少温差造成浊度漂移。
3. 仪器与耗材预检
使用芬兰Bioscreen原厂200孔蜂窝板，检查板底透光面无划痕、色素残留；配备原厂防蒸发盖板与透气封膜，适配48 h长时序监测。
仪器提前预热30 min，清洁孵育舱、光路窗口与托盘积水菌斑，执行完整光路基线校准。检查温控、间歇振荡、串口通讯稳定性，确保长时间连续扫描无断连、无板位温差异常。
二、二维复合浓度矩阵标准化加样操作
1. 等高线二维矩阵布局逻辑
单块板内构建6×6二维浓度网格，横向为物质A浓度梯度，纵向为物质B浓度梯度，每一格代表一组固定配比复合抗菌体系。边缘全部设置缓冲孔，缓解边缘水分浓缩导致药物浓度假性升高。
单孔固定体系终体积250 μL，加样顺序为先加入恒温平衡肉汤，再依次加入对应梯度的物质A、物质B稀释液，最后加入标准化对数期菌悬液，轻柔吹打混匀，禁止剧烈摇晃造成抗菌成分沉淀。
细菌统一校准至终接种量5×10⁵ CFU/mL，真菌2×10⁶ cells/mL，所有孔位起始总菌量保持一致，消除接种量差异干扰生长曲线对比。
2. 除泡与防蒸发封板处理
加样完成逐孔清除液面微小气泡，气泡会造成光路瞬时突变，扭曲AUC数值进而干扰协同等高线拟合。
加盖原厂配套防蒸发盖板，监测时长超过24 h时沿板四周粘贴半透气封板膜，保留微量气体交换同时降低水分流失，防止二维网格内浓度配比发生改变。
无尘纸巾单向擦拭板底透光面，去除水渍、指纹、抗菌色素残留，保证600 nm光路读数稳定无杂峰。
三、仪器上机与时序动力学扫描参数设置
1. 蜂窝板固定与长效供电通讯配置
将蜂窝板完全卡入仪器卡槽，卡扣卡紧无松动，缓慢闭合舱门，确认舱门传感器正常触发，防止运行震动触发开门保护中断连续时序采集。
管理员模式启动配套软件，锁定COM串口，关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠功能；整套仪器接入UPS不间断电源，规避长时间监测断电、串口断开丢失二维矩阵完整时序数据。
2. 统一扫描监测参数
细菌培养温度35±2℃，真菌28℃；全程开启低速间歇振荡，持续悬浮菌体，避免沉降掩盖低浓度微弱生长差异，保证二维网格内浊度读数可横向、纵向对比。检测波长固定600 nm。
读数间隔设置20 min，总培养时长细菌24 h，真菌延长至48 h，完整记录全周期生长动态，精准捕捉低浓度联用产生的协同抑制、拮抗恢复生长信号。
开启分类型基线校正，无菌空白、溶剂空白独立校正对应矩阵区域，消除两种抗菌物质本身色素、溶剂底色浊度干扰；时序OD数据自动保存CSV格式，每轮扫描实时写入硬盘，防止缓存丢失二维矩阵数据。
全部参数核对完成后执行10 min预扫描，确认各梯度基线分层平稳无剧烈波动，正式启动全自动连续监测，实验全程禁止开盖、修改参数、插拔通讯线缆。
四、时序数据校正、协同指数计算与等高线绘图
1. 二维矩阵批量数据校正降噪
监测结束导出整块6×6矩阵全部时序OD原始数据并备份工程文件，原始数据不做手动修改。
每组浓度组合使用配套溶剂空白、无菌空白逐点基线扣零校正；采用窄窗口移动平均滤波平滑曲线毛刺，不破坏联用带来的生长速率变化拐点。批量剔除污染、菌体大面积沉降、极端漂移的离群孔，该网格点位数据作废，复筛补充。
2. 动力学指标与协同指数FICI计算
批量拟合每个网格点位曲线AUC（曲线下总面积），以无药对照组AUC为100%生长基准，计算各组复合体系生长抑制率。
计算分级抑菌浓度指数FICI，用于判定协同、相加、无关、拮抗四类互作关系。
3. 二维等高线绘图设计逻辑
以物质A浓度为X轴、物质B浓度为Y轴，以AUC抑制率或FICI指数为Z轴数值绘制二维等高热力等高线图。
等高线颜色梯度代表抑制强度，曲线向内收缩、低浓度区域出现高抑制色块代表协同作用；等高线向外扩张、同等抑制需要更高浓度配比代表拮抗作用。
同步叠加单体MIC参考线，直观对比单独使用与复合联用抑菌效果差异，清晰展示最优协同配比区间、拮抗浓度区间。
五、协同/拮抗结果独立复筛与交叉验证
1. 二维矩阵独立批次复筛
初筛等高线图显示存在明显协同或拮抗的浓度配比区域，重新配制二维梯度肉汤、标准化菌悬液完整复测一轮，两次等高线色块分布、FICI指数区间完全一致，方可判定互作为稳定真实效应，排除单次加样、批次随机误差。
2. 多菌株交叉验证
对优势协同配比、典型拮抗配比更换多株致病菌平行测定，若多菌株等高线趋势统一，证明复合抗菌互作具有广谱性；仅单一菌株出现协同则为菌株特异性效应。
3. 终点活菌计数佐证（SCI论文配套）
选取协同、拮抗、单体对照代表性配比孔，梯度稀释涂布无药平板计数，对比各组活菌数量差异，匹配等高线动力学抑制趋势，形成动态时序+终点活菌定量双重证据链。
六、仪器收尾维护与二维矩阵数据归档
1. 微孔板无害化处理
取出蜂窝板，含复合抗菌物质、致病菌废液高温高压灭菌处理；一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板经热水、酒精多次浸泡清洗去除色素与药物残留，灭菌后存放备用。
2. 腔体长效保养与资料归档
擦拭舱内壁、托盘全部色素与冷凝水汽残留，敞开舱门通风干燥不少于2小时，防止霉菌、抗菌色素污染光路。执行完整光路基线校准，清空等高线实验自定义梯度参数，恢复仪器出厂默认设置。
完整归档二维浓度矩阵原始时序OD数据、单体MIC测定记录、FICI计算表格、等高线绘图脚本、初筛复筛热力图结果，整套复合抗菌协同拮抗等高线实验设计流程完全可复现；依次关闭软件、仪器、电脑电源。