一、实验前期体系构建与材料标准化准备
1. 受试材料、菌株与对照设置
收集不同种类天然植物提取物、中药复方提取液，所有提取液经0.22μm水系或有机系滤膜除菌，根据提取物溶解性区分溶剂体系，水溶性使用无菌肉汤溶解，脂溶性采用DMSO、乙醇低浓度助溶，溶剂终浓度控制在0.5%以内避免溶剂自身抑菌。
实验菌株包含标准质控菌株、临床致病菌、工程改造底盘菌，每组菌株设置3次生物学重复、3次技术重复。每块蜂窝板必须配套四类对照：无提取物阳性生长对照（肉汤+菌株）、无菌空白肉汤对照、对应提取溶剂空白对照、阳性抑菌药物质控对照。
如需多胁迫模拟体内环境，同步配制低营养、酸性、氧化胁迫肉汤，用于多层次筛选复合提取物抑菌潜力。
2. 梯度肉汤培养基标准化配制
统一批量配制MH肉汤（细菌）或RPMI 1640肉汤（真菌），添加缓冲盐维持全程pH稳定，避免中药有机酸、生物碱改变体系酸碱度干扰抑菌活性。
培养基121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后分装，分别配制含不同稀释梯度提取物的肉汤，设置二倍稀释梯度覆盖高、中、低浓度区间，完整捕捉弱抑菌至强抑菌区间。
配好的梯度肉汤室温静置30分钟充分去除气泡，上机前恒温平衡至培养温度，缩小温差减少冷凝漂移造成浊度读数偏差。
3. 菌株标准化悬液制备
挑取菌株单菌落活化过夜，次日传代至对数生长期，用0.5麦氏浊度管校准菌液浓度，细菌终接种量控制5×10⁵ CFU/mL，真菌2×10⁶ cells/mL。菌液现配现用，冰上暂存防止接种量自发增殖改变筛选基线。
4. 耗材与芬兰Bioscreen仪器预检
选用原厂200孔蜂窝板，检查板底透光面无划痕、色素残留、污渍；配备原厂防蒸发盖板与半透气封板膜，适配48h长时程高通量筛选。
仪器提前预热30分钟，清洁孵育舱、光路窗口、托盘积水与菌斑，执行完整光路基线校准。检测温控均匀度、间歇振荡、串口连续通讯性能，排除板间温差、长时间扫描断连故障。
二、200孔蜂窝板高通量梯度加样与封板操作
1. 标准化梯度加样流程
单孔固定终体积250μL，操作顺序为先加入恒温平衡后的梯度提取物肉汤，后加入标准化菌悬液，轻柔吹打混匀，禁止剧烈摇晃造成提取物沉淀、菌体破损。
每行横向排布一套提取物二倍稀释梯度，行末端预留三孔分别放置溶剂空白、无菌空白、无药阳性生长对照；采用棋盘交错布局分散各组梯度，边缘全部设置缓冲对照孔，缓解边缘水分浓缩导致提取物浓度假性升高。
加样完成后逐孔清除液面微小气泡，气泡会造成光路瞬时噪声，干扰低浓度微弱生长信号识别；检查所有孔无液体渗漏、板壁挂液。
2. 长效防蒸发密封处理
加盖原厂配套防蒸发盖板，总监测时长超过24h时，沿板四周粘贴半透气封板膜，保留微量气体交换通道，同时大幅降低水分流失，避免中药提取物因浓缩出现假阳性抑菌结果。
无尘纸巾单向擦拭板底透光面，去除水渍、指纹、提取物残留色素，保证600nm光路读数稳定无杂色干扰。
三、仪器上机与高通量时序扫描参数设置
1. 蜂窝板固定与长效通讯供电配置
将蜂窝板完整卡入仪器卡槽，确认卡扣完全卡紧无松动，缓慢闭合舱门，保证舱门传感器正常触发，防止运行震动触发开门保护中断连续数据采集。
以管理员身份启动配套软件，锁定COM串口，关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠功能；整套仪器与电脑接入UPS不间断电源，规避长时间高通量筛选断电、串口断连丢失时序曲线。
2. 抑菌筛选统一扫描参数
细菌培养温度35±2℃，真菌28℃；开启低速间歇振荡模式，持续悬浮菌体，避免中药沉淀、菌体沉降掩盖低浓度微弱增殖。检测波长固定600nm。
读数间隔设置20min，总培养时长细菌24h，真菌、慢生长致病菌延长至48h，完整捕捉延滞期、对数生长期、拖尾迟发增殖等特征。
开启分梯度基线校正，溶剂空白、无菌空白独立校正对应梯度组，消除中药色素、有机溶剂本身带来的底色浊度干扰；时序OD数据自动保存为CSV格式，每轮扫描实时写入硬盘防止缓存丢失。
全部参数核对完成后执行10min预扫描，确认各梯度基线分层平稳无剧烈波动，正式启动高通量全自动监测，实验全程禁止开盖、修改参数、插拔通讯线缆。
四、高通量数据预处理与复合抑菌活性定量筛选
1. 批量时序数据校正与降噪
筛选周期结束导出全板原始OD数据并备份工程文件，原始数据不做手动修改。
每组梯度使用配套溶剂空白、无菌空白逐点基线扣零校正；采用窄窗口移动平均滤波平滑曲线毛刺，不掩盖提取物弱抑制产生的生长速率拐点。批量标记并剔除污染、大面积沉淀、极端漂移的离群孔，该梯度组作废重测。
2. 抑菌相关动力学指标批量提取
统一拟合每条生长曲线核心定量参数：24/48h终点校正OD、最大比生长速率μ、曲线下总面积AUC、延滞期时长。
以无提取物阳性对照组AUC为100%生长基准，计算各浓度提取物生长抑制率：抑制率=(对照组AUC−提取物组AUC)/对照组AUC×100%。
延滞期显著延长、比生长速率大幅下降、AUC显著降低均判定存在抑菌活性；多参数联合评估区分弱抑菌、中度抑菌、完全抑菌复合提取物。
3. 高通量初筛阈值判定规则
设置统一初筛阈值，抑制率≥50%标记为候选活性提取物，抑制率≥99%标记为高活性提取物，抑制率低于30%判定无明显抑菌作用；仅单一浓度出现抑制标记为可疑样品，全部进入复筛队列，降低提取色素、溶剂、沉淀造成的假阳性。
五、活性提取物独立复筛与抑菌机制辅助表征
1. 独立批次二次高通量复筛
初筛标记的天然植物、中药复合提取物，重新配制梯度肉汤、标准化菌悬液上机复测，仅两次实验抑制率趋势、MIC数值保持一致，方可认定具备稳定抑菌活性，排除初次加样、批次随机误差。
2. 多菌株、多胁迫交叉验证
对复筛阳性提取物开展多种致病菌平行筛选，同时在酸性、氧化胁迫条件下重复测定，确认抑菌广谱性与体内模拟环境稳定性；仅单一菌株、单一条件下表现活性的提取物不列为优势抑菌样品。
3. MIC与AUC联合定量评价
复筛阳性样品同步判定MIC最小抑菌浓度，结合AUC积分抑制面积综合量化抑菌强度，区分快速完全抑菌、迟发拖尾抑制两类作用模式，为后续分离活性单体、机制研究提供定量表型支撑。
六、实验收尾、仪器维护与高通量数据归档
1. 微孔板无害化处理
取出蜂窝板，含中药提取物、致病菌废液统一高温高压灭菌处理；一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板经热水、酒精多次浸泡清洗去除色素残留，灭菌后存放备用。
2. 腔体长效清洁保养
擦拭舱内壁、顶盖、托盘全部色素与水汽残留，敞开舱门通风干燥不少于2小时，避免中药色素、冷凝积水滋生霉菌污染光路。
执行完整光路基线校准，清空自定义抑菌筛选实验参数模板，恢复仪器出厂默认设置。
完整归档全板时序OD原始数据、提取物梯度稀释记录、微孔板排布文件、抑制率与MIC计算脚本、初筛复筛活性样品清单，整套高通量筛选流程可完整复现；依次关闭软件、仪器、电脑电源。