一、实验前期标准化准备
1. 菌株分组与同步预培养
设置三类核心菌株：野生型亲本菌株、转录因子敲除突变株、转录因子回补菌株，回补组用于区分敲除带来的特异性代谢变化，排除随机突变假阳性。每组设置不少于3次生物学重复搭配3次技术重复，保障动力学数据统计可靠性。
挑取各组单菌落接种至基础液体培养基过夜活化，次日统一转接传代一次，消除冻存菌株生理滞后差异。低速离心收集菌体，新鲜无菌培养基洗涤两次，去除胞外代谢残留。
将菌体重悬稀释至统一初始浓度，细菌初始OD 0.05~0.1，酵母初始OD 0.02~0.05，保证所有组别起始接种量完全一致。同步准备无菌空白培养基，用于后续全时序基线校正。
如需在碳源限制、氧化、渗透压等胁迫条件下表征代谢重编程生长表型，全部组别使用同一批次胁迫培养基，仅菌株基因型存在变量。
2. 标准化培养基配制
批量配制基础培养基，按需添加筛选抗生素，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至50℃以下再加入诱导试剂、特殊碳源等热敏物质，避免高温失活。
培养基添加缓冲盐体系稳定全程pH，规避长时间培养酸碱波动干扰代谢通路活性。配制完成后室温静置30分钟充分释放气泡，上机前恒温平衡1小时，缩小培养基与仪器舱内温差，减少冷凝、蒸发造成的浊度读数漂移。
3. 耗材与仪器预检
使用芬兰Bioscreen原厂200孔蜂窝板，检查板底透光面无划痕、污渍、指纹残留。配备原厂防蒸发盖板与半透气封板膜，适配48~72小时长时程动力学监测。
提前开机预热30分钟，擦拭清洁孵育舱内壁、光路窗口、托盘，清理内部积水与菌斑，执行完整光路基线校准。检查温控均匀度、间歇振荡模块、舱门传感器、串口通讯，排查板位温差、长时间扫描断连故障。
二、微孔板标准化加样与长效封板操作
1. 加样规范流程
单孔固定体系体积200μL~350μL，统一液量降低蒸发差异干扰代谢相关浊度曲线。先加入恒温平衡后的培养基，再加入标准化菌悬液，轻柔吹打混匀，禁止剧烈震荡破坏细胞生理状态。
采用棋盘交错布局排布各组菌株，野生型、敲除株、回补株、空白校正孔均匀分散，边缘全部设置缓冲对照孔缓解边缘蒸发效应，同一基因型不集中排布在单侧区域。
加样完成后逐孔清除液面微小气泡，检查无液体渗漏、板壁挂液现象，气泡会造成光路瞬时波动，干扰生长拐点识别。
2. 长效密封处理
加盖原厂配套防蒸发盖板，监测时长超过48小时时，沿板四周粘贴半透气封板膜，保留微量透气通道维持微生物有氧代谢，同时降低水分流失改变碳氮源浓度。
无尘纸巾擦拭干净板底透光面，保证光路无杂质遮挡，避免噪声掩盖代谢重编程带来的生长速率变化信号。
三、仪器硬件放置与动力学监测参数设置
1. 蜂窝板上机固定
平稳将蜂窝板完整卡入仪器卡槽，确认卡扣完全卡紧无松动，缓慢闭合舱门，保证舱门传感器完全触发，防止长时间运行震动触发开门保护程序，中断连续时序扫描。
2. 电脑长效通讯配置
以管理员身份打开Bioscreen配套软件，锁定对应COM串口，关闭后台占用串口的程序。关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠、屏幕定时关闭功能，整套设备接入UPS不间断电源，规避长时间监测断电、串口断开导致动力学曲线断点丢失。
3. 生长动力学完整扫描参数设置
设置菌株适宜恒温，开启低速间歇振荡模式，低幅度振荡避免菌体大面积沉降掩盖生长速率差异。检测波长统一选用600nm。
读数间隔设置20min，总培养时长48~72h，完整覆盖延滞适应期、对数增殖期、平台稳定期、后期衰退期，捕捉转录因子敲除引发的全阶段代谢生长变化。
开启空白孔基线自动校正，数据设置为CSV格式实时写入硬盘，防止长时间运行缓存丢失时序数据。
全部参数核对无误后执行10分钟预扫描，确认基线平稳无无规律跳动，正式启动连续监测，实验全程禁止中途开盖、修改运行参数、拔插通讯线缆。
四、时序数据预处理与代谢相关动力学指标提取
1. 原始数据校正与降噪处理
监测周期结束停止扫描，导出全板完整时序OD原始数据并备份工程文件，原始数据不做直接修改。
对应组别使用配套空白对照逐点基线扣零校正，消除培养基底色、长期冷凝蒸发带来的基线偏移；采用窗口适中的移动平均滤波平滑曲线毛刺，不破坏代谢重编程造成的生长速率拐点。标记并剔除严重污染、菌体大面积沉降、极端漂移的离群孔。
2. 代谢重编程关联动力学参数批量拟合
使用R语言、Origin软件批量拟合每条生长曲线核心定量指标，用于表征转录因子敲除后的代谢改变：
延滞期λ：反映菌株代谢通路重构后环境适应所需时长，转录因子缺失引发代谢紊乱会显著延长延滞期；
最大比生长速率μ：直接体现中心碳代谢、能量代谢整体活力，代谢重编程抑制增殖则μ数值显著下降；
峰值最大OD：代表菌株代谢合成可支撑的极限生物量；
曲线下总面积AUC：全周期累积生长总量，综合评估整体代谢承载能力；
平台期维持时长、后期衰退斜率：反映代谢稳态维持能力，敲除后代谢失衡会出现平台期缩短、快速衰退。
3. 组间差异统计分析
同一基因型多组重复计算动力学参数均值与标准误，先开展正态性与方差齐性检验，满足条件采用单因素方差分析，整体存在差异后使用Tukey多重比较；不满足正态分布采用Kruskal-Wallis非参数检验，Dunn检验校正多重检验P值。
以野生型、回补株为双重对照，仅敲除株与二者相比动力学参数出现显著差异，可判定生长变化由转录因子缺失引发的代谢重编程导致，排除载体、随机突变带来的假表型。
五、候选菌株独立复筛与结果验证
1. 独立批次重复验证
动力学参数存在显著差异的转录因子敲除菌株，重新配制培养基、标准化接种开展一轮完整Bioscreen监测实验，两次实验动力学变化趋势完全一致，方可认定代谢重编程带来的生长表型稳定可靠。
2. 多碳源交叉表征辅助佐证
更换不同单一碳源培养基平行监测，若多碳源条件下敲除株均表现出一致生长动力学差异，说明转录因子调控全局性代谢网络；仅单一碳源出现差异，说明该转录因子特异性调控对应碳代谢通路。
六、仪器收尾清洁与实验资料归档
1. 微孔板无害化处理
取出蜂窝板，按照生物安全规范高温灭菌处理含抗生素的菌株废液，一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板多次清洗、灭菌后存放备用。
2. 腔体长效保养与数据归档
擦拭舱内壁、顶盖、托盘全部残留水汽，敞开舱门通风干燥不少于2小时，清除长时间积累的冷凝积水，防止霉菌滋生污染仪器。
执行一次完整光路基线校准，清空软件自定义动力学实验参数模板，恢复仪器出厂默认设置。
完整归档全板时序原始OD数据、微孔板菌株布局文件、动力学参数拟合脚本、统计检验结果，整套表征流程可完整复现；依次关闭软件、仪器、电脑电源。