一、实验总体设计与筛选目标
本方案基于芬兰Bioscreen高通量长时程微生物生长监测平台，针对合成生物学底盘菌株开展标准化、大批量、可定量的多维度表型筛选。筛选对象包含野生底盘菌株、基因编辑改造株、通路重构株、突变文库单克隆株。核心筛选表型包含基础生长适应性、胁迫耐受能力、代谢负荷适应性、生长稳定性、适应性代价，可批量筛选高产、抗逆、低负担、高稳定性的优质底盘菌株。整套流程实现高通量平行培养、时序动力学采集、定量表型打分、差异菌株初筛与复筛，满足合成生物学菌株库筛选、底盘性能评估、工程菌株表型鉴定需求。
二、实验前期准备
1. 菌株文库标准化预处理
所有待筛底盘菌株文库、对照菌株统一进行两轮传代活化，消除冻存生理滞后差异。野生型底盘菌株、空载对照菌株作为固定基准对照，每块筛选板必须同步搭载，用于校正板间差异与系统误差。
单菌落活化过夜后统一离心洗涤，去除残留抗生素、代谢废物，避免残留代谢物导致初筛假阳性。所有菌株统一稀释至标准化初始OD，细菌0.05~0.1，酵母底盘0.02~0.05，保证全文库起始生理状态、接种量完全一致。
全部待筛菌株设置技术重复，关键文库批次搭配生物学重复，满足高通量筛选统计学可信度。预留无菌空白培养基孔，用于全时序基线校正。
2. 多维度筛选培养基体系配制
为实现底盘菌株多维表型筛选，统一批次配制多组筛选培养基，包含基础营养培养基、低营养胁迫培养基、氧化胁迫培养基、渗透压胁迫培养基、酸性胁迫培养基、含筛选压力与诱导压力的工程表达培养基。
所有培养基121℃高压灭菌20分钟，冷却至50℃以下添加热敏诱导剂、筛选试剂、胁迫因子，保证批次一致性。培养基添加缓冲体系稳定pH，避免长时培养酸碱漂移干扰表型。
配制完成后静置30分钟充分除泡，上机前恒温平衡1小时，减少冷凝、蒸发、温差带来的高通量筛选系统误差。
3. 耗材与仪器高通量适配预检
使用Bioscreen原厂200孔蜂窝板，逐板检查透光面无划痕、污渍、指纹，保证高通量平行读数一致性。配备原厂防蒸发盖板与透气封板膜，适配48~72小时长时程批量筛选。
仪器提前预热30分钟，清洁孵育舱、光路窗口、托盘积水与菌斑，执行完整光路基线校准。检查温控均匀性、间歇振荡稳定性、串口通讯连续性，确保大批量长时间筛选无断连、无板位温差偏差。
三、高通量标准化上机操作流程
1. 微孔板高通量加样布局
单孔固定体系体积250~300μL，统一液量降低蒸发差异带来的批量筛选偏差。先加入恒温平衡后的各类型筛选培养基，再加入标准化菌悬液，轻柔混匀，杜绝气泡与挂壁。
采用标准化棋盘交错布局，待筛文库菌株、野生对照、空载对照、空白校正孔均匀分散排布，边缘全部设置缓冲孔，规避边缘蒸发效应导致的批量假阳性。不同胁迫、不同筛选条件分区排布，保证每块板内部对照完整、体系独立。
2. 高通量防蒸发封板处理
加盖原厂防蒸发盖板，长时程筛选实验四周粘贴透气封板膜，兼顾微生物气体交换与整体防蒸发效果，保证多日批量筛选体系稳定。无尘纸巾擦拭板底透光面，保证光路洁净无噪声干扰。
3. 仪器长效稳定参数设置
蜂窝板完全卡入卡槽，闭合舱门确认传感器正常触发。电脑关闭休眠、USB省电、硬盘休眠功能，整机接入UPS不间断电源，防止大批量筛选中途断连、断电丢失数据。
统一设置底盘菌株适宜培养温度，开启低速间歇振荡，防止菌体沉降造成表型误判。检测波长固定600nm，读数间隔20分钟，总培养时长48~72小时，完整覆盖延滞期、对数期、平台期、衰退期全周期表型。
开启分条件空白基线校正，数据实时保存CSV格式，预扫描确认基线平稳后启动高通量连续监测，全程禁止开盖、改参数、插拔线缆。
四、高通量数据预处理与底盘表型定量筛选
1. 批量数据校正与降噪
筛选结束导出全部时序OD数据，逐孔、逐条件完成空白基线扣零校正，消除培养基底色、漂移、冷凝误差。采用适度移动平均滤波平滑曲线噪声，批量剔除污染、沉降、异常漂移离群孔，保证高通量数据可靠性。
2. 底盘菌株核心表型参数批量提取
统一批量拟合所有菌株生长动力学参数，包含延滞期、比生长速率、最大生物量、曲线下总面积、平台期稳定性、衰退速率。多参数联合定义底盘菌株综合表型，避免单一OD判读误差。
延滞期代表菌株环境适应能力，比生长速率代表底盘基础增殖活力，最大OD与AUC代表整体生物合成承载能力，平台期稳定性代表菌株培养稳定性，衰退速率代表抗老化与抗胁迫能力。
3. 多维表型打分与初筛阈值判定
以同板野生底盘菌株、空载改造株为基准，计算每株突变/改造株的相对生长适应度、适应性代价指数。多条件下综合打分，筛选出低代谢负担、高胁迫耐受、生长稳定、增殖优良的优质底盘菌株。
设置统一初筛阈值，显著优于对照的菌株标记为优势底盘菌株，显著生长缺陷、稳定性差的菌株标记为劣势底盘菌株，介于区间内的菌株标记为可疑菌株，全部进入复筛队列。
五、阳性菌株复筛与表型验证流程
1. 独立批次二次高通量复筛
初筛获得的全部候选底盘菌株，重新独立配制培养基、重新标准化接种、上机复测，排除初筛随机误差、板间误差。仅两次筛选表型趋势一致、参数差异稳定的菌株，判定为真实表型菌株。
2. 多条件交叉验证
对优质底盘菌株开展多胁迫、多营养条件交叉验证，确认优良表型为菌株固有特性，而非特定培养条件的偶然结果，筛选得到通用性强、稳定性高的合成生物学底盘菌株。
3. 统计学差异验证
对初筛、复筛参数开展方差分析与多重比较，量化底盘菌株与野生型、空载对照的表型差异显著性，保证筛选结果具备统计学可信度，可用于后续菌株改造、机制研究、工程应用。
六、实验收尾与高通量数据归档
1. 微孔板无害化处理
实验结束统一灭菌处理工程菌、突变文库废液，一次性耗材直接丢弃，可复用板清洗灭菌后备用，杜绝菌株交叉污染。
2. 仪器维护与数据归档
清洁孵育舱水汽与污渍，敞开舱门通风干燥，防止霉菌滋生。完成光路校准，恢复仪器默认参数。完整归档高通量原始时序数据、板布局、参数拟合脚本、表型打分表、初筛复筛菌株清单，保证整套筛选流程完全可复现。