一、实验前期准备
1. 菌株与噬菌体标准化制备
准备宿主野生细菌、无噬菌体空白细菌对照、纯噬菌体空白对照。宿主细菌单菌落接种至液体培养基过夜活化，次日转接传代至对数生长期，此时细菌生理状态统一，裂解曲线重复性稳定。
低速离心收集对数期菌体，新鲜培养基洗涤一次并重悬，测定菌液OD，统一稀释至0.1初始接种浓度。
梯度稀释噬菌体原液，设置多组感染复数MOI梯度，常用梯度0.001、0.01、0.1、1、10，用于区分弱侵染、强侵染动力学差异。
单独配制三类空白培养基：无菌种空白、仅宿主菌无噬菌体空白、仅噬菌体无宿主空白，分别对应不同组别基线校正，排除噬菌体、细菌本身底色干扰。
2. 侵染培养基统一配制
批量配制无抗性基础液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌20分钟；培养基添加缓冲盐稳定pH，避免长时间培养酸碱变化改变噬菌体侵染效率。
培养基冷却后静置30分钟充分去除气泡，上机前恒温放置至培养温度，缩小温差减少舱内冷凝漂移，防止浊度读数波动误判裂解信号。
3. 耗材与仪器预检
使用芬兰Bioscreen原厂蜂窝板，检查板底透光面无划痕、污渍；准备原厂防蒸发盖板，适配长时间裂解动态监测。
提前开机预热30分钟，擦拭孵育舱内壁、光路窗口，清理内部积水菌斑，执行完整光路基线校准。检查温控均匀度、间歇振荡电机、舱门传感器、串口通讯，确认无板位温差、长时间扫描断连故障。
二、微孔板梯度MOI加样与封板操作
1. 标准化侵染加样流程
单孔固定体系体积200μL~350μL，操作顺序为先加入恒温平衡后的基础培养基，再加入标准化对数期宿主菌悬液，最后加入对应稀释梯度的噬菌体原液，轻柔吹打混匀，禁止剧烈震荡破坏噬菌体颗粒。
板布局采用棋盘交错排布，不同MOI侵染组、纯细菌对照组、纯噬菌体空白、无菌空白孔均匀分散，边缘设置缓冲对照孔缓解蒸发漂移，同一MOI组别不集中单侧排布。
加样完成后逐孔清除液面微小气泡，检查无液体渗漏、板壁挂液，气泡会造成光路瞬时突变，干扰裂解曲线拐点识别。
2. 封板预处理
加盖原厂配套防蒸发盖板，监测时长超过24h可使用半透气封板膜沿板四周密封，保留微量透气通道维持细菌有氧代谢，同时减少水分流失改变体系MOI比例。
无尘纸巾擦拭干净板底透光面，去除水渍、指纹、残留培养基，避免光路持续噪声掩盖裂解下降信号。
三、仪器硬件放置与软件长效监测配置
1. 蜂窝板上机固定
平稳将蜂窝板完整卡入仪器卡槽，确认卡扣完全卡紧无松动，缓慢闭合舱门，保证舱门传感器完全触发，防止运行震动触发开门保护中断时序扫描。
2. 电脑通讯搭建
以管理员身份打开Bioscreen配套软件，在设备管理器确认COM串口无其他程序占用，匹配仪器串口波特率参数建立稳定连接。
关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠、屏幕定时关闭功能，整套设备接入UPS不间断电源，规避长时间监测断电、串口断开导致裂解时序断点丢失。
3. 裂解动力学扫描参数完整设置
设置细菌适宜恒温，开启低速间歇振荡模式，低幅度振荡保证细菌均匀悬浮，避免菌体沉淀掩盖裂解浊度下降信号；检测波长统一选用600nm。
读数间隔统一设置10min，噬菌体裂解存在快速浊度下降拐点，短间隔采样可精准捕捉裂解起始时间、裂解速率；总培养时长设置24h，完整覆盖潜伏期、上升生长期、快速裂解期、二次生长恢复期全阶段。
开启分类型基线扫描，纯细菌空白、无菌空白、噬菌体空白分别作为对应组别校正基准；设置数据自动存储格式为CSV，勾选全程时序OD实时写入硬盘，防止缓存丢失裂解拐点数据。
全部参数核对无误后执行10分钟预扫描，确认基线平稳无无规律跳动，正式启动连续监测，实验全程严禁中途开盖、修改运行参数、拔插通讯线缆。
四、实验结束后数据预处理与裂解动力学参数提取
1. 原始时序数据校正降噪
监测周期结束停止扫描，软件导出全板完整时序OD原始数据并备份工程文件，原始数据不直接修改。
对应组别使用配套空白对照逐点基线扣零校正，消除培养基、噬菌体颗粒本身带来的底色偏移；采用窗口较小的移动平均滤波平滑曲线毛刺，不掩盖裂解阶段快速下降拐点。标记并剔除严重污染、菌体大面积沉降、极端漂移的离群孔。
2. 裂解特征动力学指标批量提取
使用R语言、Origin软件对每条侵染曲线提取核心特征参数：
潜伏期时长：从接种到浊度首次明显下降的时间；
裂解下降速率：浊度快速下降阶段线性拟合斜率，数值绝对值越大裂解速度越快；
最大浊度峰值：裂解发生前细菌达到的最高OD，代表噬菌体侵染前细菌增殖上限；
裂解最低浊度：裂解完成后体系最低浊度，反映噬菌体裂解效率；
二次回升斜率：裂解后期细菌耐受突变株增殖回升速度。
对比不同MOI梯度下各项参数变化，MOI越高通常潜伏期越短、裂解速率越快、最低浊度更低。
3. 组间差异对比与重复验证
同一MOI多组技术重复计算均值与标准误，绘制多MOI裂解曲线叠加图；采用方差分析对比不同MOI下潜伏期、裂解速率参数差异，判断噬菌体侵染剂量效应。
裂解动力学趋势特殊的MOI组别，独立重复一轮完整Bioscreen侵染实验复现验证，区分蒸发、沉降带来的假浊度下降与真实噬菌体裂解信号。
五、仪器收尾清洁与实验资料归档
1. 微孔板无害化处理
取出蜂窝板，按照生物安全规范高温灭菌处理含噬菌体与宿主菌废液，一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板多次清洗灭菌备用，防止噬菌体污染后续实验。
2. 腔体长效清洁保养
擦拭舱内壁、顶盖、托盘全部残留水汽，敞开舱门通风干燥不少于2小时，清除长时间积累冷凝积水，避免霉菌滋生。
执行一次完整光路基线校准，清空软件自定义裂解实验参数模板，恢复仪器出厂默认设置。
完整归档全板时序OD原始数据、微孔板MOI布局文件、动力学参数提取脚本，整套噬菌体裂解动力学实验流程可完整复现；依次关闭软件、仪器、电脑电源。