一、实验前期准备
1. 菌株群体构建与同步预培养
构建竞争群体，包含野生型、突变株、标记对照菌株，各菌株携带差异化稳定分子标签用于后期区分，无标签菌株无法完成群体定量竞争分析。
单独活化每一株菌株，挑取单菌落过夜培养，次日统一传代一次，消除冻存带来的生长差异。
离心收集各菌体，使用基础培养基洗涤两次去除残留代谢物，分别测定OD，按照实验预设竞争比例混合调配群体，整体初始混合OD统一至0.02~0.05，保证整体接种浓度处于仪器线性检测区间。
设置纯培养基空白对照用于基线校正，每组竞争群体设置不少于3次生物学重复、3次技术重复；同时设置单一菌株单独培养对照组，作为单独生长基准。
如需添加氧化、渗透压、营养限制等筛选压力，全部压力条件统一添加至同一批次基础培养基，仅群体菌株组成存在变量。
2. 竞争培养基长效配制
统一批次配制基础液体培养基，搭配缓冲体系稳定pH，避免长时间培养pH偏移干扰竞争优势；121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至50℃以下再添加胁迫试剂、筛选药物。
培养基静置40分钟充分去除气泡，上机前放置恒温台平衡2小时，缩小培养基与舱内温差，减少长期培养冷凝、蒸发漂移。
3. 耗材与仪器高通量预检
使用芬兰Bioscreen原厂200孔蜂窝板，检查板底透光面完整无划痕、污渍；准备原厂加厚防蒸发盖板与半透气封板膜，适配长时间高通量平行竞争培养，降低水分流失干扰群体生长比例。
提前开机预热仪器40分钟，擦拭孵育舱内壁、顶盖、光路窗口，清理内部积水、霉斑；执行完整光路基线校准，检测温控均匀性，排查板位温差；测试串口长时间连续通讯稳定性，确认振荡电机、舱门传感器无故障。
二、200孔板加样与群体密封处理
1. 标准化高通量加样
单孔固定终体积300μL，提升液体总量降低蒸发带来的浓度波动。先加入恒温平衡完成的竞争培养基，再加入提前调配好的混合菌株群体，轻柔吹打混匀，禁止剧烈摇晃产生大量气泡。
采用棋盘交错布局排布不同竞争群体组别，单一菌株对照孔、空白校正孔均匀分散在板内各处，边缘位置全部布置缓冲对照孔，缓解边缘孔水分快速蒸发造成的生长偏差，避免同一竞争组别集中单侧放置。
加样完成后逐孔清除液面微小气泡，检查孔内无液体渗漏、板壁挂液。
2. 长效防蒸发封板
加盖原厂配套防蒸发盖板，再用半透气封板膜沿板四周完整密封，保留微量透气通道满足细胞气体交换需求，大幅降低多日平行培养过程的整体失水，防止群体浓度失衡。
无尘纸巾擦拭干净板底透光面，去除水渍、指纹、残留培养基，避免光路持续读数噪声干扰OD曲线采集。
三、仪器硬件放置与长效稳定运行配置
1. 蜂窝板固定放置
平稳将200孔蜂窝板完整卡入仪器卡槽，确认卡扣完全卡紧无松动，缓慢闭合舱门，保证舱门传感器完全触发，防止长时间运行震动触发开门保护程序中断扫描时序。
2. 电脑与供电长效设置
以管理员身份打开Bioscreen配套软件，锁定对应COM串口，关闭其他占用串口的后台程序。关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠、屏幕定时关闭等省电功能，防止长时间监测中断通讯。
整套仪器、电脑统一接入UPS不间断电源，规避多日高通量平行培养中途断电、断连，保证连续时序数据无断点。
3. 软件高通量平行监测参数设置
设置菌株适宜恒温（酵母30℃，细菌37℃），选用低速间歇振荡模式，减少细胞沉降结块，同时避免液面剧烈挥发改变渗透压。检测波长统一选用600nm。
读数间隔常规设置20~30分钟，总培养时长根据竞争周期设定48~72h；开启实时自动存储CSV格式时序OD数据，设置每轮扫描数据即时写入硬盘，防止长时间运行缓存丢失数据。
开启初始基线扫描功能，以分散排布的空白孔作为统一校正基准。
全部参数核对无误后执行10分钟预扫描，确认基线读数平稳无持续漂移，正式启动全板高通量平行扫描；实验全程禁止中途开盖、插拔通讯线缆、修改运行参数。
四、高通量数据预处理与群体竞争适应性分析
1. 原始时序数据导出校正
竞争周期结束停止扫描，导出全板完整时序OD原始数据并备份工程文件，留存原始数据不做直接修改。
利用空白对照孔时序数据逐点完成基线扣零校正，消除培养基底色、冷凝、缓慢蒸发带来的基线偏移；采用适度移动平均滤波平滑曲线随机噪声，标记并剔除污染、严重沉降、极端漂移的离群孔。
2. 批量生长动力学参数提取
利用R语言、Origin批量拟合每条竞争曲线核心参数：延滞期λ、比生长速率μ、最大OD、AUC曲线下总面积，以AUC作为群体整体生长得分，定量反映混合群体综合适应能力。
对比混合群体与单一纯培养菌株的相对AUC、相对比生长速率，判断群体内菌株竞争优势强弱；分段提取早期、中期、后期动力学指标，分析竞争优势随时间的动态变化。
3. 竞争适应性统计分析
采用重复测量方差分析对比不同竞争群体全周期生长曲线差异；使用单因素方差分析结合Tukey多重检验，量化各组群体生长适应能力差异显著性。
计算竞争适应指数，以单一野生菌株纯培养为基准，量化突变株在混合群体中的竞争增益或生长劣势；区分沉降、蒸发、板位温差带来的仪器误差与真实细胞群体竞争差异，存在显著竞争表型的组别独立重复一轮高通量平行培养复筛验证。
如需精准区分群体内各菌株占比，可在培养终点取出菌液，结合qPCR、测序定量各标签菌株丰度，匹配生长曲线动态变化综合判定竞争适应性。
五、实验收尾与仪器防潮维护
1. 微孔板无害化处理
取出200孔蜂窝板，按照生物安全规范高温灭菌处理混合群体废液，一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板多次清洗、灭菌后存放备用。
2. 腔体长效清洁保养
擦拭舱内壁、顶盖、托盘全部残留水汽，敞开舱门通风干燥不少于2小时，清除长时间积累的冷凝积水，避免霉菌滋生污染仪器。
执行一次光路基线校准，清空自定义实验参数模板，恢复仪器出厂默认设置；完整归档全板时序原始数据、板布局文件、动力学拟合脚本、竞争指数计算代码，保证整套高通量平行竞争实验流程可完整复现；依次关闭软件、仪器、电脑电源。