一、实验前期准备
1. 菌株同步预培养
准备待测野生酵母、衰老相关突变菌株，挑取单菌落接种至标准YPD或合成缺陷培养基，30℃过夜活化。次日转接传代一次，消除冻存菌株生理差异，保证所有菌株初始生长状态统一。
低速离心收集菌体，新鲜培养基洗涤两次去除代谢废物，重悬后测定OD并稀释至0.02~0.05，处于仪器线性检测区间。每组设置不少于3次生物学重复与3次技术重复，单独配制无菌种空白培养基用于基线校正。
若实验需要诱导时序衰老，可搭配碳源限制、氧化预处理等衰老诱导条件，所有处理仅单一变量，其余培养基成分完全一致。
2. 长效培养基配制
选用缓冲体系稳定pH，避免长时间培养pH大幅偏移；统一批次配制后121℃灭菌20分钟，冷却至50℃以下按需添加诱导试剂、筛选抗生素。
培养基充分静置40分钟彻底去除气泡，上机前置于30℃恒温台平衡2小时，缩小培养基与仪器舱内温差，减少长期监测过程中持续冷凝、蒸发漂移。
3. 耗材与仪器长效预检
使用芬兰Bioscreen原厂200孔蜂窝板，检查板底透光面无划痕、污渍；配套原厂加厚防蒸发盖板，搭配半透气封板膜，适配60小时以上长时间培养，缓解水分流失与冷凝水滴落干扰。
提前开机预热仪器40分钟，擦拭清洁孵育舱内壁、顶盖、光路窗口，清理内部积水、残留菌斑，执行完整光路基线校准。检查温控均匀性、振荡电机、舱门传感器，确认无板位温差故障；测试串口通讯稳定性，排查长时间运行断连隐患。
二、微孔板标准化加样与长效封板
1. 加样操作规范
单孔固定体系体积300μL，更高体积可以降低长时间培养水分蒸发带来的浓度偏差。先加入恒温平衡完成的长效培养基，再加入标准化菌悬液，轻柔吹打混匀，避免剧烈震荡产生气泡。
采用棋盘交错式板布局，待测菌株、野生对照、空白校正孔均匀分散排布，边缘孔全部设置缓冲对照，降低边缘孔加速蒸发造成的时序漂移。
加样完成后逐孔清除液面微小气泡，检查无液体渗漏、板壁挂液。
2. 长效密封处理
先盖原厂配套防蒸发盖板，再使用半透气封板膜沿板四周完整密封，仅保留微量透气通道满足酵母有氧代谢，大幅减少60h以上培养过程的整体失水。
无尘纸巾擦拭板底透光面，去除水渍、指纹、残留培养基，防止光路长期读数持续产生噪声。
三、仪器硬件放置与长效运行配套设置
1. 蜂窝板固定放置
平稳将蜂窝板完整卡入仪器卡槽，确认卡槽卡扣完全卡紧无松动，缓慢闭合舱门，确认舱门传感器完全触发，防止长时间运行中轻微震动触发开门保护程序中断扫描。
2. 电脑与供电长效配置
以管理员身份启动Bioscreen配套软件，在设备管理器锁定对应COM串口，关闭所有软件串口占用进程。关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠、屏幕定时关闭功能。
整套仪器、电脑统一接入UPS不间断电源，规避60小时以上连续监测中途断电、串口断开，保证时序数据完整无断点。
3. 软件长效监测参数完整设定
孵育温度固定30℃，设置低速间歇振荡模式，低频率振荡避免酵母大量沉降结块，同时减少液面剧烈挥发。检测波长选用600nm。
读数间隔统一设置30分钟，总培养时长设定70h，预留10h缓冲时长，保证完整覆盖60h衰老时序区间。
开启全程自动时序数据存储，存储格式选择CSV，勾选每轮扫描数据实时写入本地硬盘，避免长时间运行数据缓存丢失。
开启初始基线自动扫描，指定分散排布的空白孔作为统一校正基准。
全部参数核对无误后执行10分钟预扫描，确认基线平稳无持续漂移，正式启动连续监测，全程严禁中途开盖、插拔数据线、修改运行参数。
四、超长时序数据预处理与衰老表型分析
1. 原始数据导出与校正
60h以上监测周期结束后停止扫描，导出全板完整时序OD原始数据并备份工程文件，留存原始数据不可直接修改。
利用空白对照孔逐点做基线扣零校正，消除长时间培养基底色、冷凝、缓慢蒸发带来的基线偏移；选用窗口点数适中的移动平均滤波平滑曲线毛刺，不破坏衰老阶段真实生长拐点。标记并剔除严重沉降、污染、边缘极端漂移的离群孔。
2. 衰老相关动力学参数批量拟合
使用R语言grofit、growthcurver包批量拟合每条曲线全周期参数：延滞期λ、比生长速率μ、最大OD、AUC曲线下总面积。
早期阶段参数反映菌株增殖活力，后期40~60h区间曲线下降幅度、平台期衰减速率作为衰老定量指标；计算衰老阶段相对生长得分，对比野生型与衰老突变株的时序衰退差异。
可分段拆分0–30h青年期、30–60h衰老期分别提取参数，区分增殖能力与时序衰老衰退表型。
3. 统计学差异验证
采用重复测量方差分析对比全时序生长曲线整体差异，搭配单因素方差分析对比各阶段动力学参数；多重检验校正P值，判定衰老表型差异是否显著。
区分蒸发、沉降、板位温差造成的仪器系统误差与真实酵母时序衰老衰退，差异显著的菌株独立重复一轮60h长效监测复现验证结果。
五、仪器长效收尾与防潮维护
1. 微孔板无害化处理
取出蜂窝板，按照生物安全规范高温灭菌处理长期培养的高菌密度废液，一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板多次清洗灭菌备用。
2. 腔体防潮长效保养
擦拭舱内壁、顶盖、托盘全部残留水汽，敞开舱门通风干燥至少2小时，清除长时间积累的冷凝积水，防止霉菌滋生。
再次执行光路基线校准，清空软件自定义长效参数模板，恢复仪器出厂默认设置；完整归档60h时序原始数据、板布局、动力学拟合脚本，保证整套长效监测流程可重复；依次关闭软件、仪器、电脑电源。