一、实验前期准备
1. 菌株同步预处理
准备待测菌株与野生型对照菌株，分别挑取单菌落接种至基础液体培养基过夜活化。次日转接传代一次，消除冻存菌株生长滞后，保证所有菌株生理状态一致。
离心收集菌体，新鲜培养基洗涤一次并重悬，测定菌液浊度并稀释至统一初始浓度，细菌OD 0.05~0.1，酵母/真菌OD 0.02~0.05。
每组设置不少于3次生物学重复与3次技术重复，单独预留纯空白培养基，用于后续基线校正。
2. 三类应激培养基配制
统一配制基础培养基，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至50℃以下再添加应激试剂，防止高温破坏活性物质，除应激变量外其余成分完全一致。
氧化应激组：添加梯度浓度过氧化氢或百草枯，设置无氧化剂正常培养基作为对照。
渗透压应激组：添加不同浓度NaCl或山梨醇构建渗透压梯度，配套正常渗透压对照组。
低pH应激组：使用柠檬酸-磷酸盐缓冲体系稳定酸性pH，设置中性pH对照组。
全部培养基静置30分钟去除气泡，上机前恒温放置至培养设定温度，减少温差结露干扰。
3. 耗材与仪器预检
使用芬兰Bioscreen原厂蜂窝板，检查板底透光面无划痕、污渍；准备原厂防蒸发盖板，降低长时间培养冷凝水滴落、水分不均蒸发问题。
提前开机预热30分钟，擦拭孵育舱内壁与光路窗口，清理积水、霉斑，完成一次光路基线校准；检查温控、振荡电机、舱门传感器、串口通讯，确认无板位温差故障。
二、微孔板加样与封板操作
1. 标准化加样
单孔固定反应体积200~350μL，先加入恒温平衡后的应激培养基，再加入标准化菌悬液，轻柔吹打混匀。
板内采用棋盘交错排布，正常对照组、氧化应激、渗透压应激、低pH应激、空白孔均匀分散放置，边缘孔设置缓冲对照孔缓解蒸发漂移。
加样完成逐孔检查，清除液面气泡，确认无液体渗漏、管壁挂液。
2. 封板处理
加盖原厂配套防蒸发盖板，3天以上长期培养可搭配半透气封板膜密封板四周，兼顾微生物气体交换与防蒸发需求。
无尘纸巾擦拭板底透光面，去除水渍、指纹、残留培养基，避免光路读数产生持续噪声。
三、仪器硬件放置与软件参数设置
1. 蜂窝板上机放置
将蜂窝板平稳卡入卡槽，确认完全卡紧无松动，缓慢关闭舱门，保证舱门传感器完全闭合，防止运行中触发安全程序中断扫描。
2. 电脑通讯搭建
以管理员身份打开配套软件，在设备管理器确认COM串口无其他程序占用，匹配仪器串口参数建立稳定连接。
关闭电脑自动休眠、USB省电、硬盘休眠功能，整套设备接入UPS不间断电源，规避断电断连风险。
3. 扫描与培养参数设置
设置菌株适配恒温，开启低速间歇振荡模式，防止菌体沉降结块、大量气泡生成；检测波长统一600nm。
读数间隔根据菌株生长速度选择，常规细菌20min，酵母、慢生长真菌30min；总培养时长细菌24~48h，真菌最长7天。
开启初始基线扫描，指定空白孔作为校正基准，数据存储格式设置为CSV，全程时序OD自动保存。
全部参数核对无误后执行预扫描，确认初始基线平稳无大幅跳动，正式启动连续监测，全程禁止中途开盖、修改参数、拔插通讯线。
四、数据预处理与适应性定量分析
1. 原始数据导出校正
培养结束停止扫描，导出全板时序OD原始数据并备份工程文件。
使用空白对照逐点基线扣零校正，消除培养基底色与基线漂移；采用移动平均滤波适度平滑曲线噪声，标记并剔除污染、严重沉降、异常漂移的离群孔。
2. 生长动力学参数批量拟合
使用R语言、Origin批量拟合每条曲线四项核心参数：延滞期λ、比生长速率μ、最大OD、AUC曲线下总面积。
延滞期λ数值越大，代表菌株适应对应应激环境所需时间更长，耐受能力更弱；比生长速率μ越低，应激对菌体增殖抑制越强；最大OD和AUC综合代表应激环境下整体累积生物量，全面反映菌株长期适应能力。
计算应激组相对于正常对照组的相对参数比值，量化生长抑制水平。
3. 统计学差异验证
采用t检验、单因素方差分析对比对照组与各应激组参数差异，判断适应性差异是否具备统计学显著性；绘制生长曲线叠加图、参数柱状图直观对比菌株耐受差异。
区分沉降、冷凝、板位温差带来的仪器误差与真实菌株应激表型，结果存在争议时开展独立重复实验复现验证。
五、实验收尾与仪器维护
1. 微孔板无害化处理
取出蜂窝板，按照生物安全规范灭菌处理废弃菌液，一次性蜂窝板直接丢弃，可复用板充分清洗灭菌备用。
2. 腔体清洁与设备归档
擦拭舱内壁、顶盖、托盘残留水汽，敞开舱门充分通风干燥，避免冷凝积水滋生霉菌；完成光路基线校准，恢复软件默认参数。
完整归档原始时序数据、板布局模板、数据分析脚本，保证整套实验流程可完整复现；依次关闭软件、仪器、电脑电源。