一、实验前期准备
1. 菌株验证与同步预培养
准备野生型菌株、基因敲除突变株、基因回补株，通过PCR或测序完成基因型验证，排除杂菌污染与基因型错误。
挑取单菌落接种至对应液体培养基过夜活化，次日转接传代一次，消除冻存带来的生长滞后差异。
离心收集菌体，新鲜培养基洗涤1次并重悬，测定菌液OD，稀释至统一初始浓度：细菌0.05~0.1，酵母/丝状真菌0.02~0.05。
每组设置至少3次生物学重复与3次技术重复，保证数据重复性。
2. 培养基配制与分组设置
统一批次配制基础培养基，如需添加胁迫、药物、特殊碳氮源，待灭菌冷却至50℃以下再加料混匀，调节固定pH。
单独配制无菌种空白培养基，用于后续基线校正。
分组包含：野生对照组、单基因敲除株组、回补株组，若需多重胁迫可增设氧化、渗透压、低pH处理亚组。
培养基全部121℃高压灭菌20min，冷却静置除气泡，实验前恒温平衡至培养温度。
3. 耗材与仪器预检
使用原厂配套蜂窝板，检查板底透光面无划痕、污渍；准备原厂防蒸发盖板，减少冷凝水干扰。
提前开机预热仪器30min，擦拭孵育腔体、光路窗口，清理内部积水霉斑，执行一次光路基线校准。
检查温控、振荡、舱门传感器、串口通讯功能是否正常，确认无板位温差故障。
二、微孔板加样与封板操作
1. 标准化加样流程
单孔体系固定200μL~350μL，先加入平衡温度的培养基，再加入稀释完成的标准化菌悬液，轻柔吹打混匀。
板布局采用棋盘分散排布，野生、敲除、回补菌株交错放置，空白对照孔均匀分散在板内各处，边缘孔可设置缓冲孔降低蒸发漂移。
加样完成后逐孔检查，移除液面气泡，杜绝液体渗漏、挂壁现象。
2. 封板处理
加盖原厂适配盖板，长期培养可搭配半透气封板膜封闭板四周，兼顾气体交换与防蒸发效果。
无尘纸巾擦拭板底透光面，去除指纹、水渍、残留培养基，避免光路读数产生噪声。
三、仪器硬件放置与通讯搭建
1. 微孔板放置
将蜂窝板平稳卡入仪器卡槽，确认完全卡紧无松动，缓慢关闭舱门，确认舱门闭合到位，防止运行中触发安全保护中断扫描。
2. 电脑通讯设置
以管理员身份打开Bioscreen配套软件，查看电脑设备管理器，确认COM端口无其他软件占用，匹配仪器串口波特率等参数建立连接。
关闭电脑自动休眠、USB节能、硬盘休眠功能，整套设备接入UPS不间断电源，规避断电断连风险。
四、软件完整参数设置
1. 新建实验工程
创建新实验文件，保存路径不包含中文与特殊字符；录入完整板布局信息，标注每孔菌株类型、处理条件、重复编号，保存布局模板便于后续数据匹配。
2. 培养与扫描参数设定
设置目标孵育温度，开启间歇振荡模式，避免菌体沉降结块；检测波长固定600nm。
根据菌株生长速度选择读数间隔：快速细菌20min，酵母、慢生长真菌30min；设置总培养时长，常规细菌24~48h，真菌最长7天。
3. 基线与存储参数
开启初始基线扫描，指定空白对照孔作为校正基准；设置数据存储格式为CSV，勾选全程时序OD数据自动保存。
核对全部参数无错误后执行预扫描，确认初始基线平稳无大幅跳动，正式启动连续监测。
实验全程禁止中途开盖、修改参数、拔插通讯数据线。
五、实验结束后数据处理与表型分析
1. 原始数据导出预处理
培养周期结束停止扫描，软件导出完整时序OD原始数据并备份工程文件。
采用空白对照逐点基线扣零校正，使用移动平均滤波适度平滑曲线噪声，标记并剔除污染、严重沉降、漂移异常的离群孔。
2. 生长动力学参数批量拟合
使用R语言growthcurver包、Origin等工具批量拟合所有曲线核心参数：延滞期λ、比生长速率μ、最大OD、AUC曲线下总面积。
对比敲除株与野生、回补株的各项参数，计算相对生长抑制指数，定量判断敲除菌株是否存在生长缺陷、应激敏感等表型。
3. 统计学验证
采用t检验、单因素方差分析判断各组参数差异显著性；绘制叠加生长曲线与参数柱状图。
若敲除株生长显著异常，且回补株表型恢复至野生水平，可判定该基因参与调控菌株生长或胁迫适应。
六、仪器收尾清洁与维护
1. 微孔板处理
取出蜂窝板，按照生物安全规范灭菌处理废弃菌液，一次性板直接丢弃，可重复板充分清洗灭菌备用。
2. 腔体维护
擦拭舱内壁、顶盖、托盘残留水汽，敞开舱门通风干燥，防止冷凝积水滋生霉菌。
再次执行光路基线校准，恢复软件默认参数，依次关闭软件、仪器、电脑电源，完整归档实验数据、板布局、分析脚本。