1.1.2主要试验用品
MRS肉汤培养基、胰蛋白大豆琼脂(tryptic soy agar,TSA)培养基、琼脂粉(agar powder)、过氧化氢酶(CAT,400 000 U/g)购自北京索莱宝有限责任公司,胰蛋白大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司,乳酸链球菌素(Nisin,900 IU/mg)购自北京酷来搏科技有限公司,MRA琼脂培养基是在MRS肉汤培养基中添加1.5%的琼脂粉经120℃高压灭菌20 min后制成。
1.1.3主要仪器设备
Bioscreen全自动生长曲线分析仪,;冻干机(型号FDU-1200)。
1.2试验方法
1.2.1乳酸菌的分离与纯化
对从牛场采集的牛粪和羊瘤胃内容物以及青贮饲料样品进行乳酸菌菌株分离。首先对牛粪样品采用TSB培养基进行富集,然后在TSA平板上进行划线分离,在37℃进行培养,直至长出单克隆,反复纯化3次,得到18株细菌(F3-1①、F3-1②、F3-2①、F3-2②、F3-3①、F3-3②、F3-5①、F3-5②、F4-1①、F4-1②、F4-2①、F4-2②、F4-3①、F4-3②、F4-5①、F4-5②、F4-2③、F4-2④)。将羊瘤胃内容物样品用MRS肉汤培养基富集后,首先在MRS琼脂培养基的平板上划线分离,在含5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养,直至长出单克隆后用接种环无菌挑取白色黏液样单克隆接种到3 mL MRS肉汤培养基中,继续在含5%CO2培养箱中培养12 h以上;如此重复3次,直至划线出形态相似,均一大小,边缘整齐不透明,具有白色黏液样的单克隆,做革兰氏镜检,得到9株疑似乳酸菌(N1-1①、N1-1②、N2-1①、N3-1①、N4-1①、N4-1②、N5-1①、N5-1②、N7-1①)。按照羊瘤胃内容物菌株分离方法处理青贮饲料样品,分离得到2株细菌(S1-1①、S2-1①)。对上述29株分离细菌分别扩增16S rDNA,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
1.2.2 16S rDNA测序鉴定
PCR扩增体系:5.0μL 10×PCR Buffer,1μL正向引物27F,1μL反向引物1492R,2μL模板基因组DNA,0.5μL 5 U/μL Pfu DNA聚合酶,加ddH2O至50μL。反应程序:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,72℃延伸10 min,扩增34个循环。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.2.3乳酸菌生长特性及产酸能力测定
乳酸菌生长特性及产酸能力测定。对分离纯化并经16S rDNA测序的疑似乳酸菌的4株分离菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①活化后按照995μL MRS肉汤培养液加5μL菌液的接种量接种,37℃恒温培养36 h,每个样品制备3管,以空白培养基为对照,通过实时微生物生长分析系统连续测定600 nm波长下的吸光度(OD600 nm)值,同时测定菌液在培养0、2、4、6、8、12、24、36 h时的pH,以菌液培养时间为横坐标,OD600 nm值和pH为纵坐标分别绘制生长曲线和产酸曲线。同时对上述菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶接触试验。
1.2.4 Nisin效价标准曲线绘制
准确称取1.00 g的Nisin标准品,溶于1 mL灭菌蒸馏水中,配成1 000 mg/mL的母液。再用灭菌蒸馏水稀释成500、250、100、50、25 mg/mL的Nisin标准液。采取牛津杯双层琼脂平板法测定稀释后的各浓度Nisin标准液对金黄色葡萄球菌ATCC29213株的抑菌圈直径,以抑菌圈直径为纵坐标,以Nisin浓度的对数为横坐标,绘制标准曲线。
1.2.5乳酸菌抑菌试验及抑菌物质效价测定
制备1.5%的琼脂平板,等间距放入4个经过高温灭菌后的牛津杯。将金黄色葡萄球菌ATCC29213株接种在TSB培养基中37℃恒温培养过夜。制备200 mL含0.7%琼脂的金黄色葡萄球菌培养基(0.7%TSA培养基),冷至50℃左右,将过夜培养的金黄色葡萄球菌ATCC29213株调整至0.5麦氏比浊(1.5×108 CFU/mL),按1%的接种量接种2 mL稀释后的金黄色葡萄球ATCC29213株菌液,混匀。在放置牛津杯的素琼脂平板上倒入15 mL含有金黄色葡萄球菌ATCC29213株的0.7%TSA培养基,晾干后用无菌镊子取出牛津杯,在孔中加入100μL分离的乳酸菌无菌发酵上清液(按照1.2.6中原液组的方法制备),在超净工作台中鼓风扩散3 h后,放置于37℃恒温培养箱培养16~24 h观察,并用游标卡尺测定抑菌圈直径,计算抑菌物质效价。
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