3讨论
TCA循环是以乙酰辅酶A为底物，使用8种不同酶催化每一步反应，最终生成草酰乙酸和2份的CO2(https://www.britannica.com/science/tricarboxylic-acid-cycle)。已有研究发现TCA反应过程中酶的活性或中间产物的产生可调控细菌的生物被膜形成、多糖细胞间黏附素合成、持久性细胞形成及细菌毒力等。然而，与植物病原细菌TCA循环相关的研究报道则非常少，仅见到TCA循环可影响植物病原细菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)对拟南芥的毒力以及D.dadantii对大白菜和马铃薯的毒力。
在TCA反应过程中，α-KGDH是催化α-酮戊二酸氧化脱羧反应的关键酶，进而形成琥珀酰辅酶A和CO2，同时伴随NADH的产生；α-KGDH缺乏会影响α-酮戊二酸向琥珀酰辅酶A的转化。α-KGDH是一种由E1、E2和E3亚基共同组成的复合酶，其中E1亚基由sucA基因编码。Zhao等]发现了sucA基因可影响多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对碳源的利用效率和菌株自身存活率。在E.coli中，sucA基因突变可直接影响与TCA循环相关的酶活性和胞内代谢产物浓度；该基因在ymdB基因的调控下可下调表达，进而影响细菌生物被膜的形成、降低抗生素耐药性。细菌生物被膜、耐药性等细菌表型的变化表明了sucA基因与细菌毒力相关，Yi等研究也发现sucA基因的突变可显著减弱苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对昆虫的毒力。然而，关于sucA基因作用于细菌毒力的研究仍然较少，特别是尚未见该基因在植物病原细菌中的生物学功能的相关报道。因此，本研究首次在植物病原细菌中开展了sucA基因的生物学功能研究，明确该基因对D.zeae细菌毒力的影响可为进一步研究TCA循环调控细菌和寄主植物互作提供研究依据，并为植物病原菌致病机制提供新的见解。
本研究通过基因敲除突变和遗传互补的功能验证方法明确了sucA在香蕉细菌性软腐病菌D.zeae MS1中可决定α-KGDH生成和活性的生物功能(图2A)。在Dickeya中，D.zeae MS1与菊迪克氏菌(D.chrysanthemi)、D.dadantii、方中达迪克氏菌(D.fangzhongdai)和茄迪克氏菌(D.solani)的代表性菌株的SucA蛋白序列是高度保守的，相似性达到96%–97%。与溶果胶菌科的另一成员Pectobacterium菌株进行比对，发现D.zeae MS1的SucA蛋白序列与胡萝卜果胶杆菌(P.carotovorum)和多功能果胶杆菌(P.versatile)的代表性菌株同样具有较高的相似性(88%)。尽管SucA蛋白序列的系统发育树分析表明Dickeya和Pectobacterium与肠杆菌目其他属细菌具有明显区别，D.zeae MS1与Klebsiella、拉乌尔菌属(Raoultella)、Enterobacter、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、Escherichia、Erwinia和Edwardsiella等不同属的代表菌株仍然具有较高的相似性(83%–89%)，D.zeae MS1与其他目的细菌如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)则仅有中等相似性(59%)。这些表明sucA基因在包括E.coli在内的肠杆菌目细菌中广泛存在且较为保守，在该类细菌中可能具有相似的分子作用机制。本研究在Tn5转座子插入突变体库中随机筛选到多个插入到sucA基因不同位点而引起毒力显著减弱的突变体；然而，关于sucA基因影响植物病原细菌毒力的研究也未见相关报道。因此，本研究需进一步分析sucA基因突变减弱细菌性软腐病菌毒力与哪一类毒力因子相关。
在细菌性软腐病菌重要毒力因子PCWDEs中，T2SS分泌的Pel和Cel是造成软腐症状的“强大火力”，而T1SS分泌的Prt也可破坏植物细胞壁的完整性或者影响病原菌分泌蛋白的活性。在本研究中，sucA基因突变致使Pel、Cel和Prt均显著减少分泌，该表型的变化可能是sucA基因突变体的毒力基本丧失的重要原因。已有研究表明，D.dadantii中编码延胡索酸酶的fumA和编码琥珀酸脱氢酶的sdhCDAB等TCA循环相关基因的突变可降低细胞内c-di-GMP的产生并提高Pel的产生，该结果不同于本研究发现的sucA基因突变致使PCWDEs分泌显著降低。对此，本研究比较了c-di-GMP合成关键酶二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC)的编码基因gcpA的转录水平变化，发现该基因在突变体与野生型间并未表现明显转录表达差异。在D.zeae中，DGC蛋白可通过调控整合宿主因子(integration host factor,IHF)来改变c-di-GMP水平，进而影响细菌的游动性和Pel与Prt的活性。然而，本研究发现sucA基因敲除突变体的细菌运动性并未与PCWDEs一样受到影响，sucA基因敲除突变体的细菌涌动性和游动性与野生型均无明显差异，均表现良好的细菌运动性。D.dadantii的fumA和sdhCDAB的基因突变可改变c-di-GMP的胞内水平并影响其运动性，sucA基因的突变则并未影响c-di-GMP合成关键酶基因gcpA的表达和细菌运动性。因此，与fumA和sdhCDAB等TCA相关基因不同，sucA对PCWDEs分泌的影响应是通过不同的作用途径来实现。后续开展sucA影响D.zeae分泌PCWDEs的作用机制研究可进一步完善TCA循环调控细菌性软腐病菌的生长和毒力等方面的基础理论，并有助于制定细菌性软腐病病害防控的新策略。
TCA循环主要受到可用底物的浓度和酶蛋白的变构调节等方面的调控，在整个反应过程中会产生多种不同的中间体且参与的酶也具有复杂多样的功能。α-酮戊二酸是平衡碳代谢和氮代谢的关键代谢产物，α-酮戊二酸的积累是对氮限制的常见反应。sucA基因的突变可引起α-酮戊二酸的积累，进而可能导致细菌体内代谢异常。细菌代谢活动对其在寄主体内定殖、侵染、致病至关重要，也是决定细菌毒力的关键因子。因此，sucA基因的突变所引起的细菌毒力显著减弱应该是多种毒力影响因素受到干扰引起的，包括PCWDEs和细菌代谢等。研究sucA影响D.zeae毒力因子PCWDEs分泌的作用机制可先探讨α-酮戊二酸积累引起的代谢异常是否致使PCWDEs的分泌显著减少。
4结论
本研究利用Tn5转座子插入突变体库筛选到菌落表型变异较为一致且毒力显著减弱的4个突变体，TAIL-PCR鉴定到该4个突变体均为插入sucA基因产生的。sucA基因的敲除突变致使细菌的α-KGDH活性完全丧失并显著减少PCWDEs的分泌，进而降低细菌对烟叶的过敏性反应和香蕉的致病性；与在D.dadantii中已报道2个TCA循环基因fumA和sdhCDAB的功能不同，sucA基因不引起PCWDEs的分泌增加，也不影响细菌的涌动和游动能力。因此，明确TCA循环相关基因对于细菌毒力的影响，可为进一步完善细菌性软腐病菌致病机制提供研究依据。
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