2.8噬菌体功能注释
目前在VFDB中尚未检索到噬菌体DK-13存在毒力基因；在CRAD数据库中也尚未检索到噬菌体DK-13存在耐药基因。使用ORFs Finder和BLAST预测噬菌体DK-13的开放阅读框并注释其功能，预测其共有293个开放阅读框（ORF），其中已知功能的ORFs共有125个，可分为6个模块：复制/重组模块、包装基因模块、结构基因模块、核苷酸代谢基因模块、转录/翻译模块和其他功能模块，使用DNAMAN绘制噬菌体DK-13的基因组注释图谱（图4）。具体包括：（1）复制/重组模块：DNA聚合酶（ORF73）在催化合成DNA中有着重要作用，相关基因还有DNA连接酶（ORF47）、DNA解旋酶（ORF92、140、167）。（2）包装基因模块：末端酶小亚基（ORF3）和末端酶大亚基（ORF13）。在噬菌体复制过程中，需要对DNA进行包装这需要ATP引导的末端酶蛋白负责将DNA切成大小序列。T holin溶解介体（ORF101）是DK-13参与裂解宿主菌的相关基因，在裂解宿主菌的过程中起着重要作用。（3）结构基因模块：与结构相关的蛋白编码基因包括主要头部蛋白（ORF22）、小外衣壳蛋白（ORF152）及短尾纤维蛋白（ORF7），它们在噬菌体吸附或感染起到重要作用。（4）核苷酸代谢基因模块：包括还原酶小亚基（ORF76），核苷三磷酸焦磷酸水解酶（ORF155）等核苷酸代谢所需的相关酶类。（5）转录/翻译模块：与噬菌体的转录和翻译有关的基因有转录修饰子（ORF135）和翻译阻遏蛋白（ORF175）等7个噬菌体基因在噬菌体合成相关蛋白过程中发挥作用。（6）其他功能基因：这一模块主要是一些目前对其在噬菌体内的功能尚不可知的蛋白。
图4噬菌体DK-13基因组注释图谱
箭头方向代表基因方向。红色：结构基因模块；棕色：包装基因模块；蓝色：核苷酸代谢基因模块；橙色：复制/重组基因模块；粉色：转录/翻译基因模块；绿色：其他功能模块；灰色：假定蛋白；黑色：GC含量
2.9噬菌体进化分析
基于噬菌体DK-13的DNA连接酶序列，使用MEGA6软件，对噬菌体DK-13做进化关系分析。在GenBank中BLAST同源蛋白建立系统发育树。结果如图5所示，噬菌体DK-13与大肠埃希菌噬菌体vB_EcoM_VR20具有较近的亲缘关系。
图5噬菌体DK-13的进化关系分析
2.10噬菌体DK-13在不同温度下对污染猪肉杀菌效果的评价
实验在4℃和37℃的条件下使用噬菌体DK-13处理被EIEC污染的猪肉样品。结果如图6所示，在4℃条件下，对照组的EIEC数量在6 h内几乎没有变化，实验组在噬菌体DK-13的作用下，EIEC数量第1小时后减少了约1.5个数量级，随后保持稳定；在37℃条件下，对照组的EIEC数量在6 h内不断增加，共增长了约2个数量级，实验组在噬菌体DK-13的作用下，EIEC数量第1小时后减少了约1.5个数量级，6 h后增长了0.5个数量级。从结果中可以看出，噬菌体DK-13在处理被EIEC污染的猪肉样品时，4℃的杀菌效果好于37℃。
图6不同温度下噬菌体DK-13对污染猪肉的杀菌效果
A:4℃下噬菌体的杀菌效果；B：37℃下噬菌体的杀菌效果
3讨论
食源性疾病是常见的全球公共卫生问题，引起腹泻，腹痛等症状，主要因烹饪时生熟不分，食品保存不当或厨师不注意卫生所致。EIEC很容易通过污染的水源和食物进行传播。研究发现，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌在动物源、零售肉制品源及人源等3种样本中传播，且大肠埃希菌耐药率最高。由于病原体对食品的污染，食品类行业每年都遭受巨大损失。噬菌体类生物制剂的出现对于食品安全的防治起到了重要作用。
噬菌体是地球上最丰富的生物体，约是全球细菌数量的10倍，噬菌体是所有新鲜食物中正常微生物中的一部分，已从各种食物中分离出来并且数量通常很多。由于常见的食品灭菌法，如巴氏杀菌法和食品高压加工法等会影响食品的外观及营养价值，且因此噬菌体可被用作食品安全的生物防治剂，且噬菌体具有高度安全性，能够特异性针对某些细菌的感染，并且保留一些食品原有特性和营养价值。Perera等的研究表明，使用ListShieldTM——一种专门针对单核细胞增生李斯特菌的市售噬菌体混合物，处理污染的生菜和烟熏鲑鱼等食物后细菌数量显著降低的同时没有改变食物的感官特性（包括味觉、视觉和嗅觉）。
本研究从污水中分离一株EIEC噬菌体DK-13，根据其透射电镜形态及进化分析表明是一株新的噬菌体，国际病毒分类委员会将其归类为有尾噬菌体目（Caudovirales）肌尾噬菌体科（Myoviridae）T4噬菌体亚科（Tevenvirinae）噬菌体。噬菌体DK-13潜伏期很短（10 min）,暴发期较短（30 min），暴发量适中（164 PFU/cell）,表明DK-13在短时间内就可以开始繁殖，在较短时间内就可完成裂解细菌的过程，因此在未来的应用实践中可较快地发挥作用；DK-13属于窄谱噬菌体，与Yuan等的大肠杆菌噬菌体DY1同样特异性较高。一方面专门针对宿主菌，对微生物群影响较小，然而另一方面却限制了噬菌体的治疗范围。因此，未来使用“鸡尾酒疗法”噬菌体组合可以更广泛地覆盖不同种属的细菌；DK-13酸碱耐受性和温度稳定性较强，具有较宽的工作范围，对环境要求低。通过生物信息学对DK-13进行全基因组及进化树分析，发现噬菌体DK-13与大肠埃希菌vB_EcoM_VR20进化关系较为相近，同属T4样噬菌体，有功能的编码区具有一定程度上的一致性，但没有明显的重排。噬菌体DK-13在4℃下6 h内对于污染猪肉的EIEC的杀菌效果比37℃较好。噬菌体可能具有不同的生理特性，在低温下比高温更有效，同时也证明噬菌体能够显著降低肉制品中大肠埃希菌的污染。噬菌体DK-13基因组不存在毒力基因与耐药基因，用于污染肉制品的防治是安全有效的，未来作为生物防治剂,具有应用前景。
当前在食品卫生防治领域，针对几种主要的食源性致病菌，目前已生产出了相对应的噬菌体制剂：一种针对李斯特的商用单噬菌体制剂可以有效降低切片火腿中李斯特菌的水平，且效果优于乳酸链球菌素和乳酸钠；另一种针对志贺氏菌的噬菌体鸡尾酒制剂ShigaShieldTM可以将生菜、鸡胸肉和鲑鱼等食物中志贺氏菌的水平显著降低。然而，仍需确定噬菌体对人体的作用及影响，对其生物学特性，免疫特性及基因分析进行更深层次的探究。随着生物技术的发展，在未来噬菌体将很快被用于食品安全的防治。
4结论
从医院污水中新分离的EIEC噬菌体DK-13，裂解性强，特异性强，对温度及酸碱稳定性良好，在污染的猪肉样品中具有较好的杀菌效果。
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