2结果
2.1Rv2029c基因扩增结果
以提取的结核基因组为模板，在设计好的引物作用下，行PCR扩增。PCR成功扩出Rv2029c DNA，大小1 020 bp。见图1。
注：1为基因Rv2029c；M为DNA2000标记物
图1结核DosR基因Rv2029c PCR结果
2.2pET30a-Rv2029c重组质粒的构建与鉴定
将挑取的单克隆菌用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切鉴定发现，阳性重组质粒能切出2条基因片段，分别为质粒pET30a(5 422 bp)和插入的目的基因Rv2029c(1 020 bp)。与连接片段大小吻合，可初步认为pET30a-Rv2029c构建成功。见图2。
注：M为DNA标记物；1～2为阴性质粒；3为阳性质粒pET30a-Rv2029c
图2 pET30a-Rv2029c重组质粒酶切鉴定结果
2.3基因测序结果和GenBank序列
比对将酶切鉴定成功的重组质粒送往南京金斯瑞公司进行测序，测序结果与GenBank所给序列进行Blast。基因Rv2029c与GenBank中所给序列完全吻合，重复率100%，基因无突变。
2.4pET30a-Rv2029c促大肠埃希菌生长的统计学分析
将3次测量获得的资料进行重复测量的方差分析，结果显示sum值观察时间效应：不同时间OD值差异有统计学意义(F=8 351.248，P<0.05)，空质粒组(pET30a)和重组质粒组(pET30a-Rv2029c)不同时间OD值差异均有统计学意义(F=3 593.681、4 125.791，P<0.05)。sum值观察处理因素效应,重组质粒组(pET30a-Rv2029c)OD值高于空质粒组(pET30a)(t=4 416.54，P<0.05)。从各时间点来看，0～5 h空质粒组和重组质粒组(pET30a-Rv2029c)OD值差异无统计学意义(t=1.372、1.220、0.894、0.935、0.787、0.395，P>0.05)，6～15 h由于加入IPTG诱导了蛋白Rv2029c的表达，OD值差异有统计学意义(P<0.05)；生长时间和处理因素存在交互效应(F=767.049，P<0.05)。见表1。
表1 0～15 h导入Rv2029c对大肠埃希菌OD值的影响
组别生长时间(h)101112131415sumFP空质粒组x0.605 0.608 0.616 0.610 0.608 0.618 0.411 3 593.6810.000 s0.018 0.007 0.010 0.011 0.014 0.011 0.272重组质粒组x1.015 1.057 1.097 1.103 1.164 1.159 0.658 4 125.7910.000 s0.023 0.017 0.027 0.026 0.056 0.022 0.476 sumx0.809 0.832 0.856 0.856 0.885 0.889 0.534*8 351.248*0.000*s0.212 0.231 0.248 0.254 0.289 0.279 0.371*t42.664 70.736 49.077 51.358 28.815 66.182 4 416.540*P0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000*
2.5pET30a-Rv2029c促大肠埃希菌生长曲线
以生长时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出大肠埃希菌生长曲线见图3。在5 h时(此时OD值约为0.45)加入IPTG，空质粒组(pET30a)大肠埃希菌在6 h进入平台期，而重组质粒组(pET30a-Rv2029c)却能继续维持对数期达10 h左右，并且突破大肠埃希菌的生长界限，使大肠埃希菌的OD值达到1.16左右才进入平台期，若以OD值反映大肠埃希菌数量，则重组质粒(pET30a-Rv2029c)能促使大肠埃希菌生长量提高1倍。
图3蛋白Rv2029c促大肠埃希菌生长曲线
3讨论
本实验发现导入了重组质粒pET30a-Rv2029c的大肠埃希菌与不导入该基因的大肠埃希菌相比，存在着某种机制使大肠埃希菌能够在低氧、营养物质匮乏的环境下继续维持在对数生长期，增强了大肠埃希菌抵抗应激环境的能力，增加了大肠埃希菌的数量。Rv2029c蛋白在Mg2+和ATP的参与下催化6磷酸果糖形成2,6二磷酸果糖，因此在糖代谢中起着重要作用。含有重组质粒pET30a-Rv2029c的大肠埃希菌可能通过Rv2029c蛋白，调节营养物质的供给，提高了对抗低氧环境，增加了利用糖酵解的能力，与不含Rv2029c的大肠埃希菌相比突破了糖代谢和糖利用的上限，促进了大肠埃希菌的生长。
结核分枝杆菌的肉芽肿环境同大肠埃希菌平台期环境相似，都存在营养物质匮乏、低氧、代谢产物增加等对细菌生存不利的因素，依此推断，结核分枝杆菌蛋白Rv2029c可能在肉芽肿环境组织中起到重要的维持细菌存活的作用。结核分枝杆菌在潜伏期为适应肉芽肿的微环境，一方面需要减少自身代谢活动从而进入休眠期，KUMAR等对DosR蛋白中的Rv0079(休眠相关翻译抑制子DATIN)的研究证实了这一点，发现此蛋白抑制了大肠埃希菌的生长，这是因为该蛋白与核糖体30S亚基结合从而阻断了蛋白合成中的翻译过程，降低了细菌的繁殖速度，使其进入休眠期。另一方面结核分枝杆菌可能需要最大限度利用环境中营养物质、氧气等满足自身生存基本需要，本文研究的结果支持了这一点，生物信息学分析表明蛋白Rv2029c为6-磷酸果糖激酶2，此蛋白属于pfkB糖激酶超家族，是糖代谢的一种重要信号酶，通过影响2，6二磷酸果糖的水平实现对糖酵解通路的调节，增强了结核分枝杆菌在肉芽肿环境中最大程度利用氧气和营养物质的能力，维持结核分枝杆菌生存基本需求。进一步研究该蛋白促进细菌糖酵解的具体机制是下一步研究的方向。
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