1.2.316SrRNA基因序列克隆与分析。
以1∶100的比例，将“1.2.2”中分离纯化的菌液接种于400μLLB液体培养基，于37℃振荡培养6h，通过细菌全基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA后对其16SrRNA进行基因克隆、测序与分析，对细菌进行鉴定，引物分别为：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR体系为20μL：1μL模板、1μL上游引物、1μL下游引物、7μLddH2O、10μL2×SanTaqPCRMix预混液，35个循环。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并于紫外光下确认产物大小符合预期，寄送至生工生物工程（广州）股份有限公司进行双向测序，并对测序结果进行分析。
1.2.4生化鉴定。
无菌条件下，取100μLS1菌液在TSA平板上划线涂板，于28"℃下培养12h，取单菌落接种在微量生化反应管中，将微量生化反应管放置28℃培养18～24h，根据杭州滨和微生物试剂有限公司《细菌微量生化反应管说明书》确认S1细菌生化反应结果。通过《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌鉴定手册》对S1生化特性进行鉴定。
1.2.5药敏试验。
在无菌条件下制备10个TSA平板，每个平板均匀涂布100μL菌液，等距平贴3张药敏纸片。以3个不同角度测量每个抑菌环直径，最后取3次测量的平均值，长度单位mm，记录在册，整理并以《NCCLS药敏试验标准》和杭州滨和微生物试剂有限公司《抗生素类药敏纸片使用说明书》为标准判断药敏试验结果。
1.2.6细菌生长曲线绘制。
在无菌条件下接种哈维氏弧菌至装有5 mL TSB培养基的试管中，于28℃培养12 h；再以1∶100比例接种菌液于装有100 mL TSB培养基的锥形瓶，于28℃培养；选择不同时间点（0、0.5、1.5、2.5、3.0、5.0、6.5、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0 h），收集菌液，在无菌条件不同稀释倍数下（×105、×107、×109和×1011倍）涂布在TSA平板上，于28℃培养箱中培养12 h后计数，有效计数范围为10～200。同时通过分光光度计在波长600 nm条件下测量该时间点的OD 600值，菌液浓度较高时，将菌液稀释至OD600值在0.4～0.6区间再进行测量，测量结果乘稀释倍数，记录在册。
2结果与分析
2.1鱼病诊断结果
对Ec1、Ec2、Ec33条患病斜带石斑鱼进行目检，发现其均体表变黑，严重溃烂并出现不规则的白色隆起疥疮。Ec1背鳍相对完好，尾鳍开始溃烂，胸部和尾部有充血。Ec2头部和胸部有白色疥疮，尾鳍有溃烂，嘴部充血。Ec3体表出现大量不规则白色疥疮，还出现了淡黄色结节，尾鳍和背鳍完全溃烂。
对Ec1、Ec2、Ec33条患病斜带石斑鱼进行剖检，发现其体内肝脏充血（图1～3）。Ec1肝脏充血肿大，脾脏糜烂消解不见，肠道内部呈黄色，有积水和胀气。Ec2鳃部糜烂呈灰色，肝脏充血，脾脏充血呈熔解态，肠道内部呈黄色。Ec3鳃部糜烂，肝脏充血，脾脏充血，肠道发红，有胀气。
根据目检结果和剖检结果，初步判断，患病斜带石斑鱼是受到细菌感染所致。
2.2细菌分离纯化
对Ec1、Ec2、Ec3体表病灶（Sk）、肝脏（Li）、脾脏（Sp）3个出现病理变化的部位在TSA平板、LB平板、TCSB平板划线接种。其中，LB平板上菌落数量相较TSA平板和TCBS平板上菌落数量明显减少，证明分离出的细菌更需要高营养培养基。TSA培养基对细菌没有筛选作用，且营养丰富，菌落生长数量最高，但形态并无较大差异。划线培养后TCBS琼脂培养基对细菌具有筛选作用，Ec1、Ec2、Ec3体表病灶（Sk）、肝脏（Li）、脾脏（Sp）3个出现病理变化的部位划线接种于TCBS平板上培养后均出现黄色且大小、形态一致的菌落。
挑选其中优势菌落，单菌落接种于400μLLB液体培养基（表1），37℃振荡培养12h后在菌液中添加等体积浓度为40%的灭菌甘油，于-80℃保存。
2.316SrRNA序列分析
将测序结果进行拼接通过Blast进行分析，并通过MEGA7.0进行多序列比对和同源建树，以Neighbor-Joining法构建系统发育进化树。分析显示，S116SrRNA基因序列为1191bp，Blast结果显示该菌株同哈维氏弧菌其他菌株差异较大，与2018年被报道的V.harveyihq-V149聚为一支（图4）。
2.4细菌生化特性
哈维氏弧菌S1的生理生化反应结果显示（表2），阿拉伯糖、鸟氨酸脱羧酶葡萄糖、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、甘露醇、蕈糖等反应为阳性，蛋白胨水、精氨酸双水解酶、核糖、肌醇、硫化氢等反应为阴性。同《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌鉴定手册》上哈维氏弧菌的生化特征吻合。
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