1.2.4生长曲线和时间杀菌曲线的测定
将没食子酸添加到腐败希瓦氏菌菌悬液(105CFU/mL)中，使其最终浓度为MIC，于28℃、110 r/min条件下培养。以未添加没食子酸的菌液为对照组。每隔2 h用酶标仪测定OD595 nm值，每组重复3次，取平均值，绘制腐败希瓦氏菌生长曲线。每隔2 h吸取各组培养液200μL，进行平板活菌菌落计数并绘制时间杀菌曲线。
1.2.5扫描电镜
取一定量已培养的腐败希瓦氏菌菌悬液，于3 000 r/min离心10 min，弃去上清液。将菌体用0.1 mol/L PBS(pH=7.4)清洗2次，于3 000 r/min离心10 min，再用PBS稀释，使菌悬液OD595 nm≈0.5。将没食子酸添加到菌悬液中，使其终浓度为MIC，置于28℃震荡培养(161 r/min)12 h。以未添加没食子酸的菌液为对照组。将各组培养液于3 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用无菌水清洗2次。将菌体与20 mL 2.5%的戊二醛溶液混匀，固定处理2 h。无菌水清洗2次后，分别在50%，70%，80%，90%的乙醇中浸泡30 min，在100%的无水乙醇中浸泡1 h进行逐级脱水。取适量菌悬液于盖玻片上，37℃下干燥72 h。将菌体进行喷金处理，采用扫描电镜对菌体微观形貌进行表征分析。
1.2.6细胞凋亡测定
细菌前处理参照1.2.5，置于28℃震荡培养(161 r/min)12 h后，将培养液于1 000 r/min离心5 min，弃上清液，0.1 mol/L PBS(pH=7.4)清洗2次，于1 000 r/min离心5 min，弃上清液。菌体用1 mL PI染液染色，于4℃避光放置30 min。1 h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
1.2.7细菌核酸泄漏测定
细菌前处理参照1.2.5，置于28℃震荡培养(161 r/min)12 h后，用0.22μm滤膜过滤菌悬液，用酶标仪测定滤液在260 nm波长下OD值，每组重复测定3次。
1.2.8细菌蛋白泄露测定
细菌前处理参照1.2.5，置于28℃震荡培养(161 r/min)12 h后，用BCA蛋白检测试剂盒对菌悬液蛋白浓度进行测定。
1.2.9电导率测定
细菌前处理参照1.2.5，置于28℃震荡培养(161 r/min)，每间隔10 min用电导率仪测定电导率，直至电导率值达到平衡值。
1.2.10统计分析
采用Excel 2010及Origin 8.5软件处理数据和生成图表，数据为重复3次所得的平均值，用SPSS 19.0(统计分析系统)进行统计学分析，检验数据的差异显著性，显著性水平为P<0.05。
2结果与分析
2.1酚酸对腐败希瓦氏菌的抑制活性
没食子酸、原儿茶酸和绿原酸对腐败希瓦氏菌的抑菌直径见表1。抑菌直径最大的为7.5 mg/mL的没食子酸，最小的为5 mg/mL的绿原酸，而2.5 mg/mL绿原酸几乎没有抑菌圈出现。3种酚酸的抑菌直径均随抑菌剂浓度的增加而增大，表明酚酸抑菌活性与其浓度呈正比。同等浓度的没食子酸、原儿茶酸和绿原酸中，没食子酸的抑菌直径均为最大，其次是原儿茶酸。表明3种酚酸对水产品腐败希瓦氏菌抑菌活性从大到小依次为没食子酸>原儿茶酸>绿原酸。
表1酚酸对腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径
采用肉汤二倍稀释法测定不同酚酸的MIC和MBC的数值，进一步比较各个酚酸对腐败希瓦氏菌的抑菌能力。没食子酸对腐败希瓦氏菌的MIC为1.25 mg/mL，MBC值为2.5 mg/mL，与其他两种酚酸相比，MIC和MBC值均最低(表2)，表明其具有较强的抗菌活性。李建科等研究了不同细菌对没食子酸的抑制效果，研究表明没食子酸对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC分别为2，4，4，4 mg/mL。表明没食子酸对腐败希瓦氏菌的抑菌效果比对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等细菌的好。
表2酚酸对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度
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