3讨论
APP引起猪的传染性胸膜肺炎，在全球范围内分布广泛。APP血清型众多，具体流行情况又根据时间和地区的不同而存在显著差异，其疫苗菌株需要根据流行毒株的变化而不断更新。随着时间变化，近几年国内5型、8型及15型等血清型也表现出流行趋势，而3型菌株检出率有所降低。国内现有的商品化灭活疫苗主要针对血清型1、2、7型，而本研究从2021—2022年采集鉴定到的53株APP临床菌株鉴定到1型25株、5型3株、7型20株、8型1株、15型4株，以1型和7型为主，5型和15型次之，8型相对较少，未检测到血清型2型和3型。目前商品化疫苗可能不能再满足临床APP防控需求，需要更新疫苗候选毒株。
为了探究分离菌株的生物学特性，首先对临床菌株的生长曲线、溶血活性及耐药性进行了检测。实验结果显示，15型菌株体外生长速率最快。结合国内APP的流行趋势，近年来，包括15型菌在内的10型之后的血清型流行率明显增加，这提示15型菌株在自然环境中可能具备较强的生存竞争力，其快速生长的特性可能有助于其在宿主体内迅速增殖，从而增加了其成为临床感染中主要血清型的潜在风险。在APP治疗手段方面，抗生素使用仍然重要手段，2014—2015年安徽地区分离到的临床APP菌株对氟苯尼考都较为敏感，但近年来，APP对氯霉素类药物耐药性呈上升趋势。本研究对临床菌株耐药性检测结果表明临床APP对恩诺沙星、青霉素、头孢噻呋最为敏感，而对多西环素、氟苯尼考、磺胺二甲嘧啶的耐药性明显升高，这可能与当地临床上药物的使用频率增加有关。
大蜡螟较容易获取，并且在实验室条件下易于养殖，目前已广泛用于各种大规模实验，也是APP等病原菌毒力初步检测的重要模型之一。该模型在样本数量大的毒力评估实验中有突出优势，操作方便，在本研究中显著降低了疫苗菌株筛选成本。虽然大蜡螟在毒力评估、免疫学实验等方面可以作为模型生物，但其生理和行为特性在某些情况下可能与更高级的模型生物有所不同，这限制了其在不同研究领域的适用性。因此，本研究首先使用大蜡螟幼虫初筛数量较多的血清1型、7型菌株，然后利用小鼠模型进一步筛选出1型、5型、7型和15型强毒株各一株，二者结果相结合分析，提高了毒力筛选的效率和正确率。国内现有的商品化灭活疫苗主要针对血清型1、2、7型。有学者将分离到的APP血清型12菌株制备灭活疫苗，发现其对1型APP感染小鼠产生40%的保护率，但对5b型APP感染不能提供有效的保护效力。这显示不同血清型菌株的交叉保护效果较差。血清型15型在近几年分离率逐渐升高，王玉国等已证明15型成为河南省优势血清型。2024年新疆某猪场爆发猪传染性胸膜肺炎，分离鉴定确定流行菌株为15型。本研究将筛选出的各血清型候选菌株制备成单价灭活疫苗，并在小鼠上评价了免疫保护效果。对于15型临床分离菌株，攻毒后，临床菌株组小鼠存活率（66.7%）高于商品化疫苗免疫组（50%），因此商品化疫苗中1、2、7型对15型具有一定的交叉保护作用，但本研究结果获得的15型菌株保护力更高，这些结果为血清15型的疫苗研制提供参考。而对于长期流行的血清型1型临床菌株，本研究中的菌株免疫剂量不到商品化疫苗中1型菌株的1/5，保护效果却与商品化疫苗均达到100%，这表明该菌株具有很好的疫苗开发潜力，可以通过优化疫苗各组分剂量来提高免疫保护效果。同时，本试验采用的氢氧化铝作为疫苗佐剂，在灭活疫苗制备中广泛应用，其主要优势在于能够显著增强体液免疫反应。但在强化细胞介导的免疫应答方面效果不那么显著，不同佐剂的选择在灭活疫苗的研究中也影响抗原免疫原性，也可能是临床分离株灭活疫苗和商品化疫苗存在差异的原因。后续可对不同的佐剂和灭活方式进行评估，从而制备对APP感染更佳保护效果的疫苗。
4结论
本研究从国内十个省份的猪场分离菌株中鉴定到APP 1型25株、5型3株、7型20株、8型1株、15型4株，各血清型菌株在体外生长存活能力强，具有不同程度的溶血活性。用大蜡螟和小鼠感染模型在血清型1、5、7、15型中各筛选到一株高毒力灭活疫苗候选菌株。其中，1型菌株灭活后能够以小于商品化疫苗中1型菌株的1/5的剂量，在同血清型攻毒实验中保护100%小鼠存活，15型菌株为商品化疫苗菌株中缺乏的菌株，其制备的灭活疫苗也能对同血清型攻毒小鼠提供保护，这些菌株具备开发为疫苗候选菌株的潜在价值。