材料与方法
细菌菌株、质粒和培养条件
本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表2。鼠疫耶尔森菌生物型Microtus菌株201对人类无毒力，但对小鼠高度毒力。细菌菌株在Luria-Bertani（LB）肉汤、脑心浸液（BHI）肉汤或含或不含最终浓度2.5mM钙的化学定义TMH培养基中生长。需要时，在培养基中添加以下浓度的抗生素：100mg/ml氨苄青霉素、20mg/ml链霉素、10mg/ml四环素和20mg/ml卡那霉素。
| 表2. 本研究中使用的菌株和质粒 | ||
| 菌株或质粒 | 相关特征 | 来源或参考文献 |
| DH5α | 克隆宿主 | 实验室保存 |
| SPY372λpir | 自杀载体pGMB151的复制宿主 | 来自黄霞教授[40] |
| 菌株201 | 鼠疫耶尔森菌生物变种microtus | [23] |
| ΔrovA | 菌株201, ΔrovA (41-139aa) | 本研究 |
| ΔrovA-pAraRovA | 含有pAraRovA的ΔrovA, Apr | 本研究 |
| pRW50 | 低拷贝lac表达报告载体, Tetr | 来自Green J教授[45] |
| pBAD24 | araBADp克隆载体, Apr | 实验室保存 |
| pAraRovA | 在EcoRI和SmaI位点含有rovA基因的pBAD24 | 本研究 |
| pGMB151 | 自杀载体; SacB1 R6K复制起点; Smr | 来自黄霞教授[40] |
| pGMB-delrovA | 含有约700 bp rovA基因上下游序列的pGMB151 | 本研究 |
| pyscN | 在EcoRI-HindIII位点插入538 bp yscN启动子, Tetr | 本研究 |
| pyscA | 在EcoRI-HindIII位点插入496 bp yscA启动子, Tetr | 本研究 |
| plcrG | 在EcoRI-BamHI位点插入513 bp启动子, Tetr | 本研究 |
| pyopN | 在EcoRI-HindIII位点插入567 bp yopN启动子, Tetr | 本研究 |
| pyopT | 在EcoRI-HindIII位点插入772 bp yopT启动子, Tetr | 本研究 |
| pyopQ | 在EcoRI-HindIII位点插入578 bp yopQ启动子, Tetr | 本研究 |
| pyopJ | 在EcoRI-HindIII位点插入502 bp yopJ启动子, Tetr | 本研究 |
| ppsaA | 在EcoRI-HindIII位点插入538 bp yscA启动子, Tetr | 本研究 |
| pompC | 在EcoRI-HindIII位点插入509 bp ompC启动子, Tetr | 本研究 |
诱变和质粒构建
使用基于自杀载体的等位基因交换方法构建ΔrovA突变株。使用引物rovA-up-F/-R和rovA-down-F/-R分别PCR扩增rovA基因上游和下游约700bp的序列（所有引物序列列于表S1作为支持信息）。然后使用EcoRI和XhoI消化rovA上游片段，使用XhoI和SalI消化rovA下游片段。将两个片段连接并克隆到大肠杆菌SPY372λpir中的自杀载体pGMB151中，生成质粒pGMB-delrovA。将该质粒电转化到菌株201中，在含链霉素的LB平板上筛选重组子，并使用引物rovA-F和rovA-R通过PCR确认。在含5%蔗糖的LB平板上反筛选失去自杀载体骨架的ΔrovA突变株。为构建互补菌株，使用菌株201的模板DNA扩增含有rovA上游约500bp序列和rovA开放阅读框的片段。PCR扩增子用SacI和PstI双酶切，然后克隆到pBAD24中，生成质粒pAraRovA。经DNA测序验证后，将质粒pAraRovA引入ΔrovA突变株中获得互补菌株ΔrovA-pAraRovA。
设计PCR引物以扩增yscA、lcrG、yscN、yopN、psaA、yopQ、yopJ、yopT和ompC基因上游约500-600bp的序列，这些序列代表相应下游基因的启动子，根据鼠疫耶尔森菌CO92质粒pCD1的注释。使用201的模板DNA进行PCR扩增后，将DNA片段消化并连接到pRW50中无启动子lacZ基因的上游，生成质粒pyscA、plcrG、pyscN、pyopN、ppsaA、pyopQ、pyopJ、pyopT和pompC。然后将这些pRW50衍生质粒分别转化到菌株201和ΔrovA突变株中。空质粒pRW50也引入两种菌株作为β-半乳糖苷酶活性测定的阴性对照。
为过量表达RovA、YopE、YopM和YopJ，使用表S1中列出的引物分别扩增这些基因，然后克隆到pET28a中，生成pHKR、pHKE、pHKM和pHKJ。表达载体的序列通过DNA测序验证。
RNA分离、微阵列杂交和分析
菌株201和ΔrovA突变株在含2.5mM钙的TMH中26°C培养至OD600 1.0。将培养物稀释20倍到新鲜无钙TMH中，26°C培养至OD600约1.0。为诱导T3SS，将培养物转移至37°C 3小时。收获前立即将细菌培养物与RNAprotect细菌试剂（Qiagen）混合以最小化RNA降解。使用MasterPure RNA纯化试剂盒（Epicenter）分离总RNA，并去除污染的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳监测RNA质量，通过分光光度法测定RNA数量。使用鼠疫耶尔森菌全基因组cDNA微阵列分析和比较野生型和ΔrovA菌株的基因表达谱。计算每个基因的mRNA水平比值，并使用微阵列显著性分析（SAM）软件鉴定基因表达的显著变化。仅选择表达变化至少两倍的基因进行进一步分析。
凝胶电泳和Western blotting
为检测rovA表达，将菌株201、ΔrovA突变株和ΔrovA-pAraRovA在BHI肉汤中26°C培养，通过向培养基中添加0.2%、0.02%或0.002%的阿拉伯糖诱导ΔrovA-pAraRovA中RovA的表达。通过离心收集细菌细胞并称重，然后按细菌沉淀重量比例重悬于SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶上样缓冲液中（每25mg 300μl上样缓冲液）。样品经15% SDS-PAGE分离，然后转移到Immobilon-P膜（Millipore）上。然后用针对RovA的多克隆抗体探测结合的蛋白质。使用与辣根过氧化物酶偶联的二抗山羊抗兔IgG（Sigma）可视化抗原-抗体复合物。
为分析Yop分泌和表达，将细菌菌株在26°C无钙TMH培养基中培养至OD600约1.0，然后转移至37°C 3小时以诱导Yops的表达和分泌。通过离心分离培养上清液和细菌细胞，并称重细胞沉淀。加入10%（v/v）三氯乙酸（TCA）后，将上清液在4°C冰上孵育过夜以沉淀蛋白质。然后以12000×g在4°C离心30分钟收集TCA沉淀的蛋白质。pH用5μl Tris-HCl缓冲液（pH 8.9）调至7.0后，按上述方法将沉淀的蛋白质按细菌沉淀重量比例溶解于SDS-PAGE上样缓冲液中。如上所述，使用针对YopE、YopJ和YopM的兔多克隆抗体分离和检测上清液和细菌沉淀中的蛋白质。
RovA和Yop蛋白多克隆抗体的制备
携带质粒pHKR、pHKE、pHKM和pHKJ的BL21(DE3)在LB肉汤中37°C生长，并用1mM IPTG诱导。将细胞重悬于50mM NaH2PO4（pH 8.0）、300mM NaCl、10mM咪唑中，使用Bandelin Sonoplus HD 2200超声破碎仪（Bandelin Electronic，德国柏林）以10%功率超声裂解，并通过14000×g离心将可溶性6×His标记的RovA、YopE、YopM和YopJ提取物与不溶性细胞物质分离。使用Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）通过亲和层析纯化6×His标记蛋白。
通过间隔两周依次注射200μg和400μg与弗氏完全佐剂（Sigma）混合的纯化蛋白，在兔体内产生多克隆抗体。一个月后，用800μg纯化蛋白与不完全佐剂（Sigma）的混合物加强免疫兔子。通过硫酸铵沉淀从兔血清中纯化IgG。
生长速率测定
将细菌菌株在TMH培养基中的过夜培养物稀释20倍到新鲜TMH中，含或不含2.5mM钙补充，至OD600约0.1，26°C培养至OD600 0.3，然后转移至37°C孵育至24小时。使用Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd，芬兰赫尔辛基）每小时监测每种培养物的OD600。
LD50测定
感染用细菌在LB肉汤中26°C培养18-20小时。将细菌培养物在磷酸盐缓冲液（PBS）中连续10倍稀释至每毫升10至104个菌落形成单位（CFU）的细菌悬液。通过在LB琼脂平板上接种培养物的连续稀释液确定实际CFU/ml数量。使用实验室动物研究中心（AMMS）的6-8周龄雌性BALB/c小鼠进行毒力测定，所有动物实验均按照中国实验动物福利与伦理指南进行。四组六只动物通过腹股沟皮下注射或尾静脉静脉注射接种连续10倍稀释的细菌细胞悬液。每天观察小鼠14天，使用Reed-Muench方法计算LD50。
电泳迁移率变动分析（EMSA）
设计引物以扩增lcrG、yscA、lcrF和psaE上游约500-600bp的序列。使用Gel Shift Assay Systems（Promega）按先前报道的方法进行EMSA。简而言之，使用[c-32P]ATP和T4多核苷酸激酶标记PCR产物的5'端。通过将结合缓冲液[20mM Tris-HCl（pH 8.0）、50mM KCl、1mM DTT、5%甘油、0.05mg/ml聚（dI-dC）]与标记DNA和各种浓度的纯化His-RovA蛋白混合，然后在室温孵育30分钟进行DNA结合。产物在0.5×TBE缓冲液中的4%（w/v）天然PAGE中分离。暴露于Kodak胶片后通过放射自显影检测放射性物质。
β-半乳糖苷酶活性测定
含有质粒pyscA、plcrG、pyscN、pyopN、ppsaA、pyopQ、pyopJ、pyopT和pompC的鼠疫耶尔森菌菌株201和ΔrovA突变株按DNA微阵列分析所述培养。使用β-半乳糖苷酶酶测定系统（Promega）按照制造商说明在细胞提取物中测定β-半乳糖苷酶活性。
电子显微镜
将细菌菌株在含钙TMH培养基中26°C培养至静止期早期（OD600 0.8-1.0），或在含/不含钙TMH培养基中26°C培养然后转移至37°C 3小时，当OD600达到0.3时。收获细菌细胞并在4°C 0.1M缓冲液（pH 7.4）中的3%戊二醛（Sigma）中固定。薄切片透射电子显微镜由军事医学科学院微生物流行病研究所病理学实验室进行。使用配备Mega View II的Philips Technai 20 TEM（Philips，荷兰）检查标本。
CFSE染色的膜通透性测定
将鼠疫耶尔森菌菌株201、ΔrovA突变株和ΔrovA-pAraRovA在26°C无钙TMH培养基中培养至OD600 0.8-1.0。离心样品，将细胞沉淀重悬于0.01M PBS中。将CFSE（Invitrogen）PBS溶液加入细菌悬液中至终浓度1μM，将染料和细菌细胞的混合物在37°C孵育10分钟。为停止染色程序，离心样品，将沉淀的细胞用PBS彻底洗涤两次，然后重悬于新鲜PBS溶液中。使用Becton-Dickinson FACS Caliber流式细胞仪对细菌进行分析。
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