变形杆菌属（Proteus）是肠杆菌科的一个种属，革兰氏阴性菌，广泛存在于爬虫、鸟类、哺乳动物和人类肠道内。变形杆菌可引发创伤感染、膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。目前，多用抗生素防控变形杆菌引起的疾病，但细菌耐药性的问题越来越严重，新种类抗生素出现短缺现象，在治疗严重的细菌感染方面产生了大量的未得到满足的医疗需求。噬菌体是细菌的天然“杀手”，不会被细菌的耐药性制约，能特异性识别并杀灭病原菌，不会破坏其他菌群。噬菌体分布广泛且具有自我繁殖能力强、专一性高等优点。关于变形杆菌噬菌体的研究，目前还处于起步阶段。关于变形杆菌噬菌体基因组的研究较少，对变形杆菌噬菌体进行分离鉴定及分析非常必要。
西南民族大学青藏高原研究院的苏雅航，侯忠余，唐俊妮*等通过对牦牛屠宰场采集污水中的细菌进行16S rRNA鉴定，发现在牦牛屠宰场存在变形杆菌污染，对食品安全造成潜在的威胁。为了更好地防治该细菌污染，减少抗生素使用，本研究以变形杆菌为宿主菌，从牦牛屠宰场采集的污水中分离得到1株裂解型噬菌体，通过研究该噬菌体的生物学特性，以及进行噬菌体基因组分析，旨在丰富变形杆菌的噬菌体库，为进一步开发新型噬菌体抗菌剂提供基础。
分离菌株的16S rRNA鉴定
分离菌株用16S rRNA基因通用引物扩增后，将67株菌PCR产物送检测序得到菌株的核酸序列，在NCBI数据库上进行BLAST，发现菌株29与粪肠球菌同源性较高，10株与变形杆菌同源性高达98%～99%，1株与葡萄球菌同源性99%。选取同源性较高的变形杆菌菌株序列，用MEGA X的Neighbor-Joining法构建系统发育树，如图1所示。结果显示，2、7、8、12、22、23、29、65、66菌株和普通变形杆菌（P.vulgaris）在同一分支上，亲缘关系较近，从分子水平确定10株菌株为普通变形杆菌。
宿主菌的耐药表型分析
本研究选取1株与普通变形杆菌同源性较高的菌株66为代表，探究其药物敏感性。如表1所示，结果发现菌株66对头孢曲松、头孢他啶、诺氟沙星、苯唑西林等6种抗生素敏感，对阿米卡星、卡那霉素、链霉素等6种抗生素中度敏感，对头孢西丁、青霉素、氨苄西林、红霉素、万古霉素等9种抗生素耐受。
分离噬菌体的噬菌斑形态与透射电镜结构
以变形杆菌为宿主菌，经3次富集后分离的到1株烈性噬菌体。选取的噬菌体经3次纯化后，经培养可在双层琼脂平板上形成清晰、透亮、大小均一的噬菌斑（图2A、B），将其命名为Proteus phage PV66。将纯化噬菌体液进行磷钨酸负染后透射电镜观察，结果显示，噬菌体由1个棒状的头部和可伸缩尾部组成（图2C、D）。头部长（140±1）nm、宽（54±1）nm，尾部长为（36±1）nm，从形态上初步判断噬菌体属于短尾噬菌体，与C3形态的噬菌体较为接近。
噬菌体裂解谱
如表2所示，通过点斑实验测定裂解谱，结果显示该噬菌体可裂解10株变形杆菌中的4株，对实验室分离的沙门噬菌、粪肠球菌、大肠杆菌和阪奇克罗诺杆菌未表现出裂解活性。表明噬菌体可裂解部分变形杆菌，其裂解效力将在后续实验中进一步研究。
噬菌体的最佳MOI测定结果
从图3可以看出，在6组不同的MOI中，当MOI为0.1时，噬菌体效价最高为3.18×1011 PFU/mL，MOI为0.001、1和10时效价次之，MOI为0.01和100效价最低，表明噬菌体PV66最佳MOI为0.1。
噬菌体的一步生长曲线测定结果
如图4所示，噬菌体的潜伏期为10 min，这段时间噬菌体量基本没有增加；爆发期为100 min，在感染后0～80 min内，噬菌体持续增长，在80 min后趋于平稳，因此噬菌体感染期的时间约为80 min。裂解末期噬菌体效价为12.2×1010 PFU/mL，感染初期宿主菌浓度为3.8×108 CFU/mL，得到噬菌体PV66感染宿主菌的裂解量约为321 PFU/cell。
理化因素对噬菌体的影响
如图5A所示，通过对噬菌体PV66温度耐受的测定，在60 min处理时间下，随着温度升高，噬菌体活性受到显著影响，在温度高于55℃，噬菌体效价开始急剧下降，在温度高于75℃，噬菌体PV66失去活性。由图5B可知，噬菌体在pH 3～12范围内，其效价均值在108以上，具有稳定和良好的裂解活性。当pH值为2和13时，完全失去感染宿主的能力。结果分析表明噬菌体作用的pH值范围较广，可具有良好的运用价值，但对高温敏感，当温度达到55℃时噬菌体活性受到明显影响。
由图6可知，噬菌体在60 min内被紫外照射后效价依然可达109 PFU/mL，但对80%丙酮耐受性较低，对50%DMSO、75%乙醇与SM液耐受性较高。
不同MOI的噬菌体对宿主菌的裂解效果
如图7所示，在10 min内，阳性对照曲线保持上升状态，MOI为0.1的曲线在0～2 h内呈上升状态后稳定不变，随后呈下降趋势，MOI为10、100、1 000的曲线与阴性对照曲线在1 h基本保持一致，由此可知，不同MOI的噬菌体可以很好地抑制宿主菌的生长，且MOI越高，抑菌效果越好。
噬菌体全基因组测序分析
基因组特征
如表3所示，基于全基因组测序结果，噬菌体PV66全序列长度为90 492 bp，基因组GC含量为38.28%。预测了143个编码序列（coding sequence，CDS），129个CDS为假想蛋白，其中9个CDS具有潜在功能，分别为DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸相关酶及结构蛋白，4个tRNA。未发现毒力基因及细菌抗性基因，未预测出噬菌体的裂解酶蛋白与Holi系统，原因可能是数据库中关于变形杆菌噬菌体功能基因的信息量不足。
噬菌体PV66基因编码与同源蛋白比对分析
将噬菌体序列注释后的结果在NCBI的NT数据库中进行比对，如表4所示，发现噬菌体与Cronobacter phage vB_CsaP_009和Proteus phage Privateer具有相似的蛋白，且均具有93%以上的核酸序列相似性。BLAST结果表明，与Cronobacter phage vB_CsaP_009相似的蛋白有111种，与Proteus phage Privateer相似蛋白有17种。vB_CsaP_009与Privateer均为C3形态噬菌体[39]，由比对结果可知，PV66与vB_CsaP_009具有较高相似性。
基因组比较分析
把噬菌体PV66的全基因组序列在NCBI进行BLAST比对，结果显示PV66与Proteus phage Privateer、Cronobacter phage vB_CsaP_009的同源性较高分别为89.34%、95.20%，与其他噬菌体基因同源性较低，将两条同源性较高的序列与PV66噬菌体系列进行基因比较，发现PV66与Proteus phage Privateer和Cronobacter phagevB_CsaP_009基因间存在缺失与插入的差异，显示PV66噬菌体可能为一个全新的噬菌体。
噬菌体的系统发育分析
选择噬菌体的主要衣壳蛋白进行进化树分析。如图8所示，发现PV66与奇异变形杆菌噬菌体podophage Privateer和克罗诺杆菌噬菌体vB_CsaP_009均有83%的相似性，进化树分析发现PV66和vB_CsaP_009处于同一分支上，结合噬菌体的电镜形态特征与噬菌体宿主菌可判断PV66为C3形态、non-Kuravirus属的噬菌体。
讨论与结论
多项研究发现，普通变形杆菌和奇异变形杆菌均对多种抗生素表现为耐药。本研究从牦牛屠宰过程中分离纯化的菌株纯培养后进行16S rRNA测序鉴定，通过在GenBank比对发现有10株菌与普通变形杆菌同源性为98%～99%，通过耐药表型的分析发现菌株对头孢西丁、青霉素、氨苄西林、红霉素、万古霉素等9种抗生素耐受，如果在牦牛屠宰过程中变形杆菌未及时清除，可能会对人类和其他动物造成潜在的危险。随着抗生素监管措施越来越严格，促使人们不断寻找新型安全的抗菌剂。噬菌体是一种特异性强且裂解性高的对细菌具有杀灭作用的病毒，对噬菌体的分离鉴定及生理特性的研究，对治疗耐药细菌感染具有重要的意义。
本研究从四川某屠宰场采集的污水中分离到1株烈性噬菌体，透射电镜发现噬菌体为罕见的C3形态噬菌体。最佳MOI为0.1，一步生长曲线表明噬菌体的潜伏期短，裂解量高，对温度的耐受值最高为65℃，pH值耐受范围2～13，对紫外线照射及有机试剂耐受性良好，且对细菌的裂解效果较好。这些性质与之前报道的变形杆菌噬菌体特性相差不大，表明噬菌体PV66具有很好的应用价值。
基因组学是从分子水平了解噬菌体特性的有效方法之一。本研究将提取到的序列选用prokka进行注释，注释出143个CDS，预测出14个CDS具有假定的功能，另外的129个CDS功能未知。注释的蛋白为DNA连接酶、DNA聚合酶及核酸有关的酶和结构蛋白衣壳蛋白，含有4个tRNA。RNA酶可确保tRNA在宿主体内保持稳定和足够的数量，以促进噬菌体蛋白质的快速产生，能够帮助噬菌体更好地适应不同的宿主菌或环境。大部分CDS功能未知，主要是因为数据库中关于变形杆菌噬菌体功能基因的信息量仍然不足，目前关于变形杆菌噬菌体功能基因的研究结果仍然很有限。因此，在噬菌体功能基因组学的研究中，未知基因功能的鉴定仍然是比较迫切的工作。
本研究以牦牛屠宰场分离到的变形杆菌为宿主菌，从污水中分离到1株烈性噬菌体PV66，是鲜少被报道感染变形杆菌宿主的短尾噬菌体，并表现出典型的尾状病毒感染特征，包括爆炸裂解行为，此种噬菌体宿主范围相对较窄，可感染与变形杆菌最接近且具有遗传亲缘关系的克罗诺杆菌。分析其生物学特性发现其具有潜伏期短、爆发量大、pH值作用范围广、温度耐受性高等优点。基因组分析预测了形态发生、裂解、DNA复制和重组以及生物合成等蛋白质功能，未发现抗生素相关基因和毒力基因，因此，噬菌体PV66将具有较好的应用于变形杆菌生物防治的潜力。
本文《1株新的变形杆菌噬菌体的分离、鉴定与生物学特性分析》来源于《食品科学》2023年44卷第18期214-222页，作者：苏雅航,侯忠余,寇肖迪,等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221003-018。
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