猪多杀性巴氏杆菌病(猪肺疫)是由猪多杀性巴氏杆菌引起的一种常见的细菌性传染病。多年来，EO630株被广泛用作猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗及其联苗的生产菌株，EO630株是用猪源B型多杀性巴氏杆菌强毒菌株经在含有海鸥牌洗衣粉的培养基中连续传代选育而得[1]。利用多杀性巴氏杆菌EO630株生产的弱毒活疫苗对猪肺疫有较好的预防效果。根据传统的发酵工艺，采用逐步增大通气量培养15 h，测定细菌生长曲线，发现EO630株在培养的第10～11小时时活菌数达到高峰期，活菌数大约在6.8×109CFU/mL。为了提高抗原活菌数，采用分段补料法进行EO630株抗原的生产试验，即在培养的第8小时和第10小时分别添加10%的新鲜培养基，培养15 h后收获，并测定细菌的生长曲线。从该生长曲线中能看出，在培养第12～13小时时，EO630株的活菌数达到高峰期，最高活菌数可达1.31×1010CFU/mL。按分段补料法共生产抗原5批，培养12 h后收获抗原，平均活菌数为1.17×1010CFU/mL，冻干后的平均存活率为69%。按《中华人民共和国兽药典2010版三部(简称《兽药典》)[2]进行安全和效力检验，检验结果均符合《药典》规定，达到预期效果。
本次传统工艺发酵培养的试验共进行4次重复，根据各个时段的活菌计数结果取平均数，最终确定该传统工艺发酵培养的生长曲线。
分段补料法发酵培养细菌发酵罐培养基量为10万毫升，接种细菌种子液2000 mL。接种完毕后，37℃静止培养1 h，然后通入洁净空气，以逐渐增大通气量的方法进行培养。通气量根据溶氧量来设置调整，2～3 h小气量通气培养，溶氧量设置在50%，在通气培养第4～6小时时，逐步增大气量，溶氧量设置为60%～100%(即培养第4小时溶氧量设置为60%，培养第5小时溶氧量调整到80%，培养第6小时溶氧量调整到100%)。培养至6 h后，全部按气量通气培养，溶氧量设定为100%来进行通气培养，待培养至第15小时时培养结束。在通气培养第8小时和第10小时，分别添加10%经灭菌的新鲜培养基(即分别添加1万毫升、1.1万毫升经灭菌的新鲜培养基)。从第4小时开始，每小时取样并进行活菌计数，测定EO630株的生长曲线。
本次分段补料法的试验共进行4次重复，根据各个时段的活菌计数结果取平均数，最终确定该分段补料法发酵培养的细菌生长曲线。
分段补料法制备抗原、疫苗通过用分段补料法和传统工艺分别发酵培养4批进行比较，摸索分段补料的发酵工艺。按2.3.3项的方法测定的生长曲线可以看出，在培养至第12～13小时时，活菌数达到最高峰。
根据摸索的分段补料发酵培养工艺共制备了5批EO630株抗原，选择在培养第12小时时即结束培养时收获抗原，并取样分别进行纯粹检验和活菌计数，按《规程》中规定的方法进行配苗、冻干。
质量检验
对每批疫苗在冻干前后分别随机取样进行活菌计数，统计疫苗的冻干存活率，并按《药典》标准，对疫苗进行安全、效力等质量检验。
结果与分析
活菌计数结果用传统发酵工艺和分段补料法分别培养EO630株，每个时段的活菌计数见表1。
生长曲线两种方法培养EO630株所得生长曲线见图1所示。
分段补料发酵工艺制备抗原的结果分段补料发酵工艺制备EO630株抗原见表2，培养至12 h收获平均菌数为117亿/mL。分段补料发酵工艺制备EO630株疫苗生产情况见表3，5批疫苗冻干后的平均存活率为69%，安全检验、效力检验均合格。
图1生长曲线
小结与讨论
根据传统的发酵工艺制备EO630株抗原，在培养6～10 h时活菌数增长很快，培养第10～11小时时活菌数达到最高峰，之后活菌数逐步下降，活菌数平均为6.8×109CFU/mL。根据分段补料工艺制备EO630株抗原，在培养6～12 h时，活菌数都一直保持较快的生长速度，在培养至12～13 h时，菌液的生长达到菌高峰，之后继续培养，活菌数呈现逐步下降的趋势，活菌数平均为1.19×1010CFU/mL，与传统发酵工艺相比，其活菌数有大幅度的增长，增菌效果明显。
采用分段补料工艺制备的5批EO630株抗原，在培养12 h时收获抗原，菌液活菌数稳定在1.08×1010～1.26×1010CFU/mL之间，菌液的平均活菌数为1.17×1010CFU/mL。该活菌数和测定生长曲线时长菌高峰期的菌数基本吻合，表明该工艺还是比较稳定的。