质粒构建、缺失和酵母转化
| 引物 | 序列(5'→3') | 限制性酶切位点 |
|---|---|---|
| 用于质粒构建 | ||
| CA1-U | CGGAATTCCTCCCCTCACTCTTCCCC | EcoRI |
| CA1-D | GGGGTACCGCACCCGTAGTTCATCCG | KpnI |
| CB1-U | CGCGGATCC AAGTGACACATACCAGCC | BamHI |
| CB1-D | CATGCATGCATTTACACGACAACGACC | SphI |
| Kan-U | CGGGGTACCCAGCTGAAGCTTCGTACGCT | KpnI |
| Kan-D | CGCGGATCCGCATAGGCCA CTAGTGGATC | BamHI |
| CA2-U | CGGAATTCCCCTGACTCATCAATGTTTATC | EcoRI |
| CA2-D | GGGGTACCGATCTTGATAGAAAGTGGGCC | KpnI |
| CB2-U | CGCGGATCCCATCATCCCTTTTATCAAAATAAGC | BamHI |
| CB2-D | CATGCATGCCGGTGTGGACAACAATGATC | SphI |
| 用于PCR验证 | ||
| C-S | GAAATAATAAGCCCAATCCCAC | - |
| K-S | CCCATATAAATCAGCATCCATG | - |
| K-X | GCTGGTCGCTATACTGCTGTC | - |
| C-X | CACTGGAGATACTTGGGACGC | - |
| Zeocin-U | CCCACACACCATAGCTTCA | - |
| Zeocin-D | AGCTTGCAAATTAAAGCCTT | - |
| 用于实时定量PCR | ||
| CAR1-F | GCTGTCCCGTGTCATTCC | - |
| CAR1-R | GACCTTCACCGTTTGTTTCTG | - |
| ACT1-F | CGTCTGGATTGGTGGTTCTA | - |
| ACT1-R | GTGGTGAACGATAGATGGAC | - |
本研究中使用的PCR引物均根据酿酒酵母S288c基因组序列（NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）设计，并列于表2。pUC19用作骨架构建重组质粒pUC-CA1B1K和pUC-CA2B2K。由于葡萄酒酵母细胞是二倍体，构建了两种重组质粒以删除CAR1基因的两个拷贝。第一个质粒pUC-CA1B1K的构建如下：用CA1-up和CA1-down引物扩增的CAR1基因上游同源片段（命名为CA1）的EcoRI和KpnI位点，克隆到pUC19克隆载体中，得到pUC-CA1质粒。用CB1-up和CB1-down引物以WY1基因组DNA为模板，通过PCR扩增CAR1的BamHI和SphI下游同源片段（命名为CB1），插入pUC-CA1的BamHI和SphI位点，得到名为pUC-CA1B1的质粒。然后，利用Kan-up和Kan-down引物从pUG6载体扩增用作G418抗性标记的KanMX标记基因序列。将KanMX标记基因序列亚克隆到pUC-CA1B1的KpnI/BamHI位点，获得名为pUC-CA1B1K的质粒（图1a）。缺失质粒pUC-CA2B2K的构建方法类似，但PCR产生的CA2和CB2片段分别与CAR1基因的上游和下游区域同源，比CA1和CB1片段更靠近CAR1基因，且分别与CA1和CB1片段不重叠（图1b）。
由于WY1菌株是二倍体，采用回溯引物破坏策略高效重复删除CAR1基因，如前所述。从重组质粒pUC-CA1B1K和pUC-CA2B2K分别通过PCR扩增CA1-loxP-KanMX-loxP-CB1和CA2-loxP-KanMX-loxP-CB2缺失盒。使用CA1-loxP-KanMX-loxP-CB1缺失盒删除第一个CAR1拷贝。使用Cre/loxP系统去除选择标记KanMX盒后，使用CA2-loxP-KanMX-loxP-CB2缺失盒删除第二个CAR1拷贝。然后，再次使用Cre/loxP系统去除KanMX盒。
酵母转化采用先前描述的醋酸锂方法进行。转化子在含300mg/L G418的YEPD平板上筛选。应用PCR验证具有准确位点整合的重组菌株。表2中设计了几对不同引物对。
发酵实验
将酵母细胞在5mL YEPD培养基中30°C、180rpm培养12小时，然后将细胞接种到50mL YEPD培养基中，30°C、180rpm培养12小时。通过离心（5000rpm，4°C，5分钟）收集细胞，并用50mL无菌水洗涤一次。将细胞沉淀重悬于5mL无菌水中，测量OD600。用细胞悬液接种（最终OD600为0.1）无菌250mL锥形瓶，瓶中装有190mL未过滤葡萄汁。使用前将锥形瓶在121°C高压灭菌15分钟。葡萄汁（20.45°Brix，pH 3.51，SO2 80mg/L）来自中国天津汉沽。混合物在25°C下发酵，每12小时称重一次以监测发酵进程，直到每日重量损失小于0.3g，即意味着发酵结束。所有发酵均进行三次重复。
实时定量PCR和酶活性测定
使用酵母RNA试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Omega公司）提取酵母mRNA。使用带有ROX（实时PCR参比染料；中国CWBIO公司）的Ultra SYBR两步RT-qPCR试剂盒，通过实时定量PCR（RT-qPCR）评估CAR1基因表达。表达水平相对稳定的肌动蛋白基因（ACT1）用作参比基因。用于扩增目标基因CAR1和参比基因ACT1小片段的引物列于表2。使用ΔΔCt方法分析与参比菌株相比缺失菌株中CAR1转录的相对定量。
对于精氨酸酶测定，将酵母菌株在YEPD培养基中30°C、180rpm培养12小时并收集。使用Beatus Schehl方法测量精氨酸酶的活性，如所述。对于每个菌株，至少测定三个独立生物学重复和技术重复。
生长曲线测定和发酵特性分析
在YEPD培养基中培养12小时后，将酵母细胞转移到新鲜YEPD培养基中，30°C培养18小时。使用Bioscreen自动生长曲线分析仪（芬兰赫尔辛基OY Growth Curves Ab有限公司）每小时测定光密度（OD600）。使用分析天平和pH计分别测定CO2重量损失和pH值的发酵性能。发酵结束后，根据国际葡萄与葡萄酒组织的方法分析残余还原糖、乙醇和总酸等代谢物。使用高效液相色谱法结合荧光检测测定尿素。在EC分析前，将葡萄酒样品在密闭容器中67°C煮沸15分钟，如同工业操作。通过固相萃取（SPE）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）按照国际葡萄与葡萄酒组织的描述定量EC含量。使用气相色谱（GC）对包括高级醇、酯类和挥发性酸在内的挥发性风味化合物进行定量测定。更详细的技术参数描述已发表。采用Gómez-Alonso等人报道的高效液相色谱法测定游离氨基酸。
统计分析
通过标准方差分析（ANOVA）确认重组菌株与其亲本菌株相比的统计显著性。本研究使用双尾检验。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
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